[发明专利]干细胞小球诱导培养液及干细胞小球培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养液，具体是一种在体外环境下培养细胞（包括肿瘤细胞系、永生化细胞系和正常细胞系等），可诱导细胞连续不断产生大量干细胞小球（spheroids）的干细胞小球诱导培养液。

背景技术

干细胞—尤其是肿瘤干细胞的研究已成为全球肿瘤研究的热点。目前，干细胞的分选基本上均利用流式细胞仪结合干细胞相关表面标志物来进行的，但干细胞在体外培养环境下极容易分化。在体外培养环境下，干细胞比较明确的特点是表达干细胞标志物，并能形成干细胞小球。干细胞小球是由一个异质化的细胞群组成：包括原始干细胞、祖细胞及部分已经分化的细胞。干细胞小球是具有干细胞特性的细胞在体外培养时展现的一种表型。迄今为止，尚未见文献报道使用培养液在体外培养环境下诱导细胞产生干细胞小球。

缺氧与干细胞的关系非常密切。缺氧微环境可促进细胞表达干细胞表型，维持干细胞于一定数目并抑制干细胞的分化。

发明内容

本发明就是为了解决使用培养液在体外培养环境下，诱导细胞产生干细胞小球的题，而提供一种干细胞小球诱导培养液及干细胞小球培养方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种干细胞小球诱导培养液，所述诱导培养液是将氯化钴（Cobalt chloride， CoCl₂）142.758-285.516 mg，紫杉醇2.135-4.27μg ，胎牛血清100-200ml，双抗生素10ml, 室温下混合于EMEM培养基中至1000ml，经0.2μ的过滤器过滤、灭菌制成。

所述干细胞小球诱导培养液，所述诱导培养液是将氯化钴氯化钴214.137mg，紫杉醇2.989μg，胎牛血清100ml，双抗生素10ml, 室温下混合于EMEM培养基中至1000ml，经0.2μ的过滤器过滤、灭菌制成。

一种干细胞小球培养方法，其是按以下步骤进行的：

a.体外原培养液培养的细胞生长至融合度达到90%，改用混合培养液培养，并在二氧化碳培养箱中第一次缺氧培养12-96小时，直至90%的细胞发生死亡；所述混合培养液是按原培养液:干细胞小球诱导培养液为2:1的混合而成；

b.待贴壁的培养细胞约只剩下10%时，去除含有死亡细胞的培养液，贴壁细胞经1×PBS洗涤2次，加入原培养液继续培养3-10天，使剩下的贴壁细胞重新增殖，待增殖的细胞密度达到90%后，重新更换混合培养液，并进行第二次缺氧培养，贴壁细胞洗涤后，原培养液中再次增殖，细胞密度达到90%，收集悬浮的干细胞小球。

所述干细胞小球培养方法，其第二次缺氧培养后，贴壁细胞洗涤，原培养液中再次增殖，待细胞密度达到90%后，移去培养瓶中的原培养液，经磷酸盐缓冲溶液洗涤后，用0.5%-2.5%胰酶消化细胞，然后再加入不含血清的原培养液继续培养细胞12小时，在培养瓶中收集悬浮的干细胞小球。

这样设计的本发明，在体外环境下诱导细胞连续不断产生大量干细胞小球，这些干细胞小球能表达明确的干细胞标志物：CD44，CD133，OCT3/4，Nanog，SOX-2和ABCG2等正常或者肿瘤干细胞标志物。

附图说明

图1是永生化细胞系NOF151hT细胞干细胞小球结构图；

图2是永生化细胞系NOF151p53ihT干细胞小球结构图；

图3是成纤维细胞系WI-38干细胞小球结构图；

图4是成纤维细胞系BJ干细胞小球结构图；

图5是乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞干细胞小球结构图；

图6是乳腺癌细胞系BT-549细胞干细胞小球结构图；

图7是卵巢癌细胞系HEY细胞干细胞小球结构图；

图8是悬浮生长的卵巢癌细胞系HEY 干细胞小球结构图；

图9是卵巢癌细胞SKOv3细胞干细胞小球结构图；

图10是人造肿瘤细胞细胞系FTE187SV40hTHras细胞干细胞小球结构图；

图11是NOF151hT细胞干细胞小球染色图；

图12是NOF151p53ihT细胞干细胞小球染色图；

图13是BT-549 干细胞小球干细胞CD44免疫组化染色图；

图14是BT-549 干细胞小球干细胞CD133免疫组化染色图；

图15是BT-549 干细胞小球干细胞SOX-2免疫组化染色图；

图16是 MDA-MB-231干细胞小球OCT3/4免疫荧光染色阳性图；