[发明专利]一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于动物细胞工程技术领域，涉及一种新的细胞系，具体涉及一种牛睾丸细胞系及其建立方法和应用。 

背景技术

疫苗是防治猪瘟主要的预防措施。用异源动物细胞生产疫苗可防止种毒毒力返强及避免使用同源动物造成其他疾病传播，如牛睾丸、羊睾丸、羊肾等原代细胞增殖CSFV C株疫苗。 

猪瘟病毒(CSFV)能在牛睾丸细胞中增殖，却不使细胞产生病变(CPE)，而且病毒的增殖能够增加原代牛睾丸细胞的传代次数和维待时间。然而长期以来，我国的猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞苗在生产中存在着许多问题：在猪瘟犊牛睾丸细胞苗生产过程中，因多利用奶牛场淘汰的新生犊牛睾丸为生产原料，受供体数量的限制而影响每批产量，如果只应用当天收集的犊牛睾丸，往往因为数量少而不便生产安排。为满足生产需求，生产中通常采用恒温保存，而常常由于冰箱的制冷机制造成的短时间温度过低（不恒温）影响睾丸细胞培养和疫苗的生产。 

随着养猪业的快速发展，猪瘟牛睾丸细胞苗需求量愈来愈大，单纯依靠犊牛睾丸细胞原代的培养难以满足生产的需要，所以建立牛睾丸细胞系迫在眉睫。同时，原代牛睾丸细胞需要采集犊牛睾丸组织来分离，其来源受到很大限制。因此，现在急需对其方法进行改进，使牛睾丸细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。 

发明内容

本发明的目的是提供一种高活性、高纯度的牛睾丸细胞系。 

本发明建立了一种牛睾丸细胞系，达到了上述发明目的。所述细胞系的保藏号为：CCTCC C201399。 

上述牛睾丸细胞系可用于生产猪瘟疫苗、羊痘疫苗和羊口疮疫苗，还可在研究病毒在猪瘟病毒、羊痘病毒、羊口疮病毒在睾丸细胞中增殖中应用；还可在分离鉴定羊痘病毒以及研制羊痘病毒疫苗中应用；还可在外源基因转染、细胞凋亡及细胞融合研究中应用。 

本发明的还提供上述细胞系的建立方法，该方法通过采集初生犊牛睾丸进行原代培养；然后向原代细胞导入编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT进行转染，后筛 选含该目的基因的阳性细胞；接着进行筛选和扩大培养，以获得永生化的牛睾丸细胞系，最后对该细胞进行冻存并保藏。 

上述的牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤： 

（1）原代培养：采集初生犊牛睾丸，剪成0.5～2.0mm³的组织块，分离得高活力的牛睾丸细胞，培养，得原代牛睾丸细胞， 

（2）转染和筛选：提取、纯化含有hTERT基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT，将提取、纯化的的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入步骤(1)所得原代牛睾丸细胞进行转染； 

（3）筛选和扩大培养：细胞转染真核表达质粒pCI-neo-hTERT后待细胞汇合至80％时，传至另一个24孔培养板中，48h后用G418筛选液进行G418筛选； 

待对照孔的细胞全部死亡后，将G418筛选液的浓度降低维持G418筛选，将G418筛选阳性的克隆细胞接种到96孔培养板中，然后消化传代至24孔培养板扩大培养，继续进行G418筛选，得抗G418的阳性细胞； 

（4）将步骤（3）所得抗G418的阳性细胞于培养箱内进行体外连续传代培养，培养超过60代，获得永生化的牛睾丸细胞系；所述体外连续传代培养采用消化法。 

上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，还包括细胞冻存步骤，该步骤按顺序如下： 

更换步骤（4）培养瓶内的培养基，继续培养； 

用胰酶消化培养细胞，然后加入培养基终止反应； 

计数； 

收集：离心，去上清液，加入冻存液，混匀，使细胞重悬，将培养的细胞分装入冻存管封口； 

预冻：4℃预冻冻存管30～60min，-20℃预冻1～2h，-70℃预冻6～12h； 

冻存：将-70℃预冻的冻存管迅速投入液氮柜中； 

所述的冻存液的各成分所占体积百分比为：10%DMSO、60%胎牛血清和30%DMEM。 

上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，步骤（1）所述的培养是指高活力的牛睾丸细胞培养于完全的DMEM培养基中； 

所述完全的DMEM培养基为向液态DMEM培养基中加入体积比为10%的胎牛血清的DMEM培养基； 

所述的液态DMEM培养基可以使用直接购买的该液体培养基，也可以是使用购买的DMEM培养基干粉配制而成。 

上述牛睾丸细胞系的建立方法，其特征在于，所述转染包括如下步骤：