[发明专利]人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的培养方法，具体涉及一种简易的、能长期维持人原代肝细胞特性与HBV易感性的肝细胞与肝非实质细胞共培养方法。 

背景技术

肝脏细胞在功能分类上可分为肝实质细胞与肝非实质细胞，肝实质细胞即为肝细胞，履行肝脏大部分功能如消化功能、能量代谢、解毒等；而肝非实质细胞包括肝星形细胞，窦状内皮细胞，肝上皮细胞，Kupffer细胞等，主要行使辅助肝细胞、肝脏免疫与肝脏结构支持等功能。目前为止，传统的共培养方法是将纯的原代肝细胞与纯的肝非实质细胞按一定比例混合培养，在共培养过程中，肝细胞与肝非实质细胞恢复了部分细胞与细胞之间的自然通讯，因此，原代肝细胞的形态特征和生理功能可以得到最大限度的维持。然而，这种传统的共培养系统有严重缺点，例如有限的细胞寿命、复杂繁琐的纯化步骤及至关重要的共培养细胞比例难以掌握。因此，急需开发一种在体外能使肝细胞分化特性得以长期维持的便捷的方法。利用原代肝细胞与肝非实质细胞混合物经低密度铺板的共培养方法，可以形成肝细胞堆积的，肝非实质细胞环绕、入侵生长的岛状结构，该方法相对简单易行，不需要繁琐的肝细胞与非实质细胞纯化过程，极大地延长了原代肝细胞的分化特性维持时间，最长维持时间长达120天。 

乙肝病毒（英文缩写为HBV）感染是一种常见病，中国约有1.7亿的乙肝携带者，每年死于相关疾病的病人约一百万。由于长期缺乏合适的抗HBV药物筛选与评价平台，HBV的治疗策略与方法相对滞 后。用于抗HBV药物筛选与评价的细胞模型长期局限于肝癌细胞系如HepG2、HepG2.2.15、Huh7等等。由于这些细胞系去分化严重，与体内肝细胞相比在分化状态上相差甚远，所以在筛选与评价抗HBV药物时不能反映药物真实的抗病毒效果与细胞毒作用。更糟糕的是这些细胞系不支持HBV感染，不能用于抗HBV感染性药物如小肽、抗体等研究。人原代肝细胞是HBV研究最为理想的细胞感染模型，大量的研究表明原代肝细胞能被HBV感染，但其在体外培养时很快失去分化特性，HBV的易感性通常也在1周内完全丢失，这严重制约了对HBV感染机制研究、药物筛选与评价的细胞模型的建立。本发明专利所述方法，通过人原代肝细胞与肝非实质细胞的共培养，原代肝细胞的肝细胞特性如形态特征、白蛋白的表达得以长期维持，对HBV的易感性维持可达72天，极大地提升了人原代肝细胞用于抗HBV药物筛选与评价的应用价值。 

大量的研究表明，肝细胞移植对肝功能衰竭病人的治疗效果卓著，可以极大缓解病人对供肝的需求，是一种很有应用前景的治疗策略。由于肝细胞体外培养相对落后，实现肝细胞的体外扩增及肝细胞分化特性的长期维持仍然是摆在医疗工作者面前的难题。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，在体外人原代肝细胞与肝非实质细胞混合物，经低密度铺板与经培养形成了肝细胞堆积的，肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构，实现了长达120天的肝细胞体外长期培养与长达72天保持HBV易感性。 

为解决上述技术问题，本发明一种人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，包括以下步骤： 

1）新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净； 

2）用37℃预热的灌注溶液II灌注步骤1）中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全； 

3）将步骤2）消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液； 

4）将步骤3）中细胞悬液通过70μm的细胞筛，得到单细胞悬液； 

5）将步骤4）获得的单细胞悬液在50×g和4℃条件下，离心5分钟沉降肝细胞与肝非实质细胞，用上述细胞洗液重悬，重复离心三次，然后利用铺板培养液重悬细胞； 

6）利用台酚蓝染色法计算步骤5）中重悬细胞的细胞密度与细胞活力；  

7）将步骤6）中单细胞悬液以≤8×10⁴活细胞/cm²的细胞密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中，胶原包被的目的是促进细胞贴壁与肝细胞特性的维持，加入铺板培养液，摇匀，在37℃、5% CO₂培养箱中培养以充分让其贴壁；经4至6小时后，加入生长培养液培养，3至4天换1次生长培养液； 

8）培养28至35天，加入含有2%DMSO的维持培养液，3至4天换1次维持培养液； 

9）培养30至40天，肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构；