[发明专利]人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法

权利要求书

1.人原代肝细胞与肝非实质细胞共培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）新鲜的肝组织经暴露的血管用灌注溶液I灌注约30分钟，直至肝组织中血液被冲洗干净；

2）用37℃预热的灌注溶液II灌注步骤1）中冲洗干净的肝组织，直至肝组织失去弹性消化完全；

3）将步骤2）消化完全的肝组织转移至含有细胞洗液的培养皿中，小心抖落消化好的细胞，形成细胞悬液；

4）将步骤3）中细胞悬液通过70μm的细胞筛，得到单细胞悬液；

5）将步骤4）获得的单细胞悬液在50×g和4℃条件下，离心5分钟沉降肝细胞与肝非实质细胞，用上述细胞洗液重悬，重复离心三次，然后利用铺板培养液重悬细胞；

6）利用台酚蓝染色法计算步骤5）中重悬细胞的细胞密度与细胞活力；

7）将步骤6）中单细胞悬液以≤8×10⁴活细胞/cm²的细胞密度接种到胶原包被的培养板或培养皿中，胶原包被的目的是促进细胞贴壁与肝细胞特性的维持，加入铺板培养液，摇匀，在37℃、5% CO₂培养箱中培养以充分让其贴壁；经4至6小时后，加入生长培养液培养，3至4天换1次生长培养液；

8）培养28至35天，加入含有2%DMSO的维持培养液，3至4天换1次维持培养液；

9）培养30至40天，肝细胞堆积形成肝非实质细胞环绕、入侵生长的肝岛状结构；

其中，所述灌注溶液I具体配方为：8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、1g/l葡萄糖、1mM丙酮酸纳、2mM乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸，调pH至7.4；

所述灌注溶液II具体配方为：8.00g/l氯化钠、0.40g/l氯化钾、3.57g/l羟乙基哌嗪乙磺酸、0.06g/l二水磷酸氢二钠、0.06g/l磷酸二氢钾、1g/l葡萄糖、1mM丙酮酸纳、5mM氯化钙、0.3g/lⅣ型胶原酶，调pH至7.4；

所述细胞洗液具体配方为：DMEM培养液中加入10% v/v胎牛血清，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素；

所述铺板培养液为：William’s E medium在使用前加入10mM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10^-7M地塞米松，ITS+premix，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，5% v/v胎牛血清；其中，ITS+premix含有6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35μg/ml亚油酸；

所述生长培养液为：William’s E medium在使用前加入10mM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10^-7M地塞米松，ITS+premix，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，20ng/ml表皮生长因子；其中，ITS+premix含有6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35μg/ml亚油酸；

含2% v/v DMSO的维持培养液为：William’s E medium在使用前加入10mM尼克酰胺，20mM羟乙基哌嗪乙磺酸，17mM碳酸氢钠，550mg/l丙酮酸钠，0.2mM抗坏血酸-2-磷酸，14mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺，10^-7M地塞米松，ITS+premix，100units/ml青霉素，100mg/ml链霉素，2% v/v DMSO；其中，ITS+premix含有6.25μg/ml胰岛素，6.25μg/ml转铁蛋白，6.25ng/ml亚硒酸，1.25mg/ml牛血清白蛋白，5.35μg/ml亚油酸。