[发明专利]测定微生物制剂降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法

权利要求书

1.一种测定微生物制剂降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法，其特征在于，其测定步骤如下：

a）将分离筛选的微生物接种培养基，振荡培养后取菌液离心，将上清液过滤，得到代谢产物；

b）对微生物的代谢产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳或双向电泳，再切取胶带或挖点酶解；

c）对胶带或胶点进行液相色谱串联质谱法分析；

d）对性质相同的不同烟叶分别用微生物制剂上清液、微生物制剂菌体、微生物制剂菌液和水进行处理，

e）对上述经过处理的烟叶进行芯片杂交，测定与植物防御应答、激素代谢、细胞周期调控和酶调控有关的基因上调表达和基因下调表达。

2.根据权利要求1所述的测定微生物制剂降低烟叶中蛋白质含量的作用因子的方法，其特征在于，步骤e）的具体步骤如下：

I  芯片设计

利用烟草4×44K芯片，根据烟草cDNA序列设计，探针长度为60-mer；

II  提取四种不同处理烟叶的RNA

（1）取不同处理的烟叶样品，取材后放入液氮中保存备用；

（2）取出各样品分别放入用液氮预冷的研钵中，加入液氮后快速磨成粉末状，转移至1.5 mL无RNase的离心管中；

（3）每0.1 g组织样品，加入1000 μL Trizol，充分摇匀，室温放置10 min；

（4）12000 rpm，4℃，离心10 min，取上清液至1.5 mL离心管；

（5）加氯仿200 μL，轻轻摇匀，静置5 min；

（6）10000 rpm，4℃，离心10 min后，取上清液至1.5 mL离心管；

（7）加异丙醇800 μL，轻轻摇匀，静置10 min；

（8）12000 rpm，4℃，离心10 min；弃上清液，加75﹪乙醇1000 μL，并将沉淀弹起来；

（9）10000 rpm，4℃，离心5 min；弃上清液，加75﹪乙醇1000 μL；

（10）10000 rpm，4℃，离心5 min；弃上清液，放置大约1 h使其干燥；

（11）用100 μL DEPC处理过的水溶解RNA并电泳检测；

III  RNA的检测

首先电泳检测RNA的完整性，然后用紫外分光光度计检测纯度和浓度，步骤如下：

（1）凝胶制备

称取0.48 g琼脂糖于25 mL ddH₂O中，加热溶解，冷却至60℃，依次加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液8 mL和甲醛溶液7 mL，室温下放置30 min，制成40 mL、浓度为1.2%的凝胶；

（2）电泳样品制备

在0.5 mL离心管中加入以下溶液：总RNA 5 μL、甲酰胺10 μL、甲醛3.5 μL和5×甲醛凝胶电泳缓冲液2 μL；将混合液置于65℃温浴15 min后，冰浴2 min；瞬时离心使管中溶液全部集中于管底，加入2 μL灭菌的经过DEPC处理的甲醛凝胶电泳上样缓冲液，混匀；

（3）电泳

取2 μL样品点样，用1×甲醛凝胶电泳缓冲液电泳；

IV  RNA 纯化 

RNA 纯化是在RNA 电泳条带没有降解的条件下进行的，具体是使用 RNeasy mini spin column 试剂盒对 RNA 进行纯化； 

（1）纯化柱的 RNA 最大结合量为 100 μg；在超净工作台中，吸取 100 μg RNA，体积不足 100 μL，取 DEPC 处理的 H₂O 补足至 100 μL 混匀；

（2）吸取 3.5 μL β-巯基乙醇加入到 350 μL RLT buffer 中混匀，然后将 β-巯基乙醇-RLT buffer 加入到 100 μL RNA 样品中混匀，再加入 250 μL 100％乙醇，用加样器上下混匀，不要涡旋和离心，作用 10-15 min；

（3）将 700 μL液体转移到纯化柱中，在柱中静止 1-2 min，室温，12000 rpm 离心 15 sec；

（4）弃去收集管中的液体，向柱中加入 500 μL RPE buffer，室温，12000rpm 离心 15 sec；

（5）弃去收集管中的液体，室温，12000 rpm 离心 1min；

（6）把纯化柱放入另一个新的 1.5 mL 离心管中，加入 30 μL 60℃预热的 DEPC 水到纯化柱上，静止 2-3 min，室温，12000 rpm 离心1 min；

（7）再在纯化柱上加入 30 μL 60℃预热的 DEPC 水，静止 2-3 min，室温，12000 rpm 离心1min；

重复一次步骤7和步骤8；

V  探针荧光标记

取5μg总RNA反转录为cDNA并进行荧光标记（Cy5 and Cy3-dCTP，GE Healthcare Cat. No. PA 55021/ PA 53021）； 1、2、3和4分别代表喷施微生物制剂的上清液、菌体、菌液和水；将1标记Cy5，4标记Cy3；2标记Cy5，4标记Cy3，进行荧光交换，比对结果取平均值；3标记Cy5，4标记Cy3；比对方式为1、2、3分别比对4；

VI  杂交与清洗

标记的 DNA 溶于 80 μL 杂交液中（3×SSC，0.2%SDS，5×Denhart’s，25%甲酰胺），于42℃杂交过夜；杂交结束后，先在 42℃左右含 0.2% SDS，2×SSC 的液体中洗 5 min，而后在 0.2×SSC 中室温洗 5 min；玻片甩干后即可用于扫描；

20×SSC 的配制：在 800 mL 水中溶解 175.3 g NaCl 和 88.2 g 柠檬酸钠，加入数滴 HCl 溶液调节 pH 至7.0，加水定容至 1 L，分装后高压灭菌；

10％SDS 的配制：在 900 mL 水中溶解 100 g 电泳级 SDS，加热至 68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至7.2，加水定容至 1 L，分装备用；

VII  芯片扫描和数据分析

用 Feature  Extraction 软件扫描芯片并提取探针信号值，再用 GeneSpring 软件进行数据分析，并筛选差异基因；标记“detected”为表达基因；将喷施MP制剂上清、菌体和菌液的烟叶样本的信号值分别比上喷施水的烟叶样本。