[发明专利]一种葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物病菌的单孢扩繁方法，具体涉及一种专性寄生的葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法。

背景技术

葡萄霜霉病Downy mildew由葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）引起，是危害葡萄生产的重要病害之一，是一种古老的世界性真菌病害，分布于世界上所有种植葡萄的国家和地区（Wong,F.P.,Burr,H.N.,and Wilcox,W.F.2001.Heterothallism in Plasmopara viticola.Plant Pathol.50:427-432.）严重影响着葡萄的产量、树势和果实品质（McRitchie JJ.Downy mildew of grape.Plant Pathology Circular,1978,193.)。

研究病原菌的分离、遗传和变异、性征和同宗或异宗配合等现象,都要求菌种从单个孢子繁殖而来。广泛应用于真菌的菌种的纯化与保存工作中。目前常用的分离方法有：琼脂平板稀释法（方中达.植病研究方法（3版）.北京:中国农业出版社,1998:137-139.Choi Y W,Hyde K D,Ho W H.Single spore isolation of fungi.Fungal Diversity,1999,3:29-38.），离体双重培养法（付有志.筛选抗霜霉病植株方法的发展—离体双重培养.葡萄栽培与酿酒期刊,1987,1:49～50.），毛细管打孔单孢分离法（董娟华，罗丽，王彩霞，冷伟锋，李桂舫，李保华.一种强寄生病原真菌的分离方法.中国农学通报,2009,25(3):210～212.)等。但上述研究方法中一些培养技术由于葡萄霜霉病菌是一种专性寄生菌，需要从活体的寄主组织中获取必要的养分，无法在合成培养基上生长，另一些离体培养技术易扩繁培养但易污染杂菌，因此若要深入开展葡萄霜霉病菌较纯培养的研究，开发一种简便快速、成功率高且纯培养的适用于此病菌的单孢快速扩繁方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作易行、成功率高且较纯的葡萄霜霉病菌的单孢分离扩繁方法。

为达到上述目的，本发明采取的葡萄霜霉病菌的单孢扩繁方法技术方案，包括下述步骤：

1）在培养皿（由皿底和皿盖组成）的皿底里叠放两层灭菌滤纸片，加入无菌水浸湿滤纸，盖上皿盖，得到叶片保湿培养装置；该步骤中滤纸片和培养皿的直径均为90mm；

2）采集单个霜霉病病斑的葡萄病叶，用无菌水将病叶表面和背面冲洗两次，然后把叶片放置在按照步骤1）所形成的保湿培养装置中，保证浸湿叶正面，保持背面朝上；

3）把步骤2）中放入叶片的培养皿置于光照培养箱培养2-4天，培养条件设定为：温度18°C，光照周期16h白天/8h黑夜；

4）选取对霜霉病菌敏感的葡萄品种，采集葡萄藤上自上而下的第2-5片叶片，首先对采集的叶片进行解剖镜镜检，确保叶面无霜霉菌落或菌丝后，进行消毒处理；该步骤中消毒处理的方法优选为用质量百分浓度为1%的次氯酸钠溶液处理30s，再用灭菌的超纯水清洗，然后用灭菌的滤纸吸干叶片表面的水分；该步骤中，优选采集葡萄藤上自上而下的第二片叶片或者第三片叶片。

5）将步骤4）消毒处理后的葡萄叶片用直径2cm的打孔器从叶片中部打取叶圆片（绕开主脉和较大侧脉），将叶圆片背面向上平摆在按照步骤1）所制备的保湿培养装置中（每皿5个叶圆片）；

6）在解剖镜下用针灸针（规格Ф0.25×40mm）将经步骤2）培养过的霜霉病叶上新产生的游动孢子囊或游动孢子囊梗转移到步骤5）的葡萄叶圆片上，盖上皿盖，然后按照步骤3）所述方法培养7-10d，在叶圆片部位形成的菌落即为葡萄霜霉病菌单斑的纯培养。

上述方法中，所述对霜霉敏感的葡萄品种优选为欧亚种葡萄常用红地球、瓶儿葡萄品种。

本发明的方法，首先诱导采集的葡萄霜霉病样在原寄生叶片上重新产生游动孢子，将新产生的单个游动孢子囊或单根孢囊梗用针灸针转移到1%次氯酸钠处理过的葡萄叶圆片上，在18℃,16h光周期的培养箱中培养7-10d，在叶圆片上形成的菌落即为分离到的葡萄霜霉病菌的纯培养。该方法简便易行，并且能够以较高的成功率（86%）分离得到葡萄霜霉病菌单孢的纯培养。

本发明可应用于葡萄霜霉病菌的单孢分离，为葡萄霜霉病菌遗传分化和群体遗传特征的研究提供了技术支持。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。