[发明专利]一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及人诱导多能干细胞的传代方法，具体涉及人诱导多能干细胞单细胞传代和培养技术。

背景技术

2006年，日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，成功获得类似于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)的多能干细胞，命名为诱导多能干细胞(iPSCs，induced pluripotent stem cell)。产生的iPSCs在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，从而对iPSCs多能性进行了肯定。依此证明处于终末分化的成熟细胞可以通过重编程技术逆转为未分化状态，而达到恢复多能性分化潜能的目的。

Shinya Yamanaka研究小组利用相同的技术，将上述同样的4个转录因子导入到人类皮肤成纤维细胞中，也成功获得了iPSCs。原代人类成纤维细胞样滑膜细胞和源自新生儿成纤维细胞的细胞系同样也可被重构成为iPSCs。这类iPSCs在细胞形态、增殖能力、表面抗原标志、基因表达谱、多潜能干细胞特异性基因的表观遗传学状态、端粒酶活性等方面与hESCs相似，并且在体外培养时和在小鼠体内畸胎瘤形成中均可分化为3个胚层的不同细胞类型(Takahashi K和Yamanaka S等人，利用特定因子诱导成人成纤维细胞到多能干细胞。细胞2007；131：861-872)。与此同时，威斯康辛大学J.A Thomson研究小组也报道了成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有hESCs基本特征的人类iPSCs，所不同的是他们使用慢病毒作为载体，并在14个候选基因中选择了Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等4个基因进行转导(俞君英等人，从人的体细胞诱导成为多能干细胞系，科学，2007；318：1917-1920)。这一被学界称为生物科学“里程碑”的重大突破有望帮助科学家绕过克隆技术的伦理、道德纷争，为医学应用打开大门。

iPSCs的出现为研究细胞核重新编程提供了新的思路，在干细胞研究领域、表观遗传学研究领域以及生物医学研究领域都引起了强烈的反响，这不仅是因为它在基础研究方面的重要性，更为再生医学带来了新的希望。在实际应用方面，iPSCs的获得方法相对简单和稳定，不需要使用生殖细胞或破坏早期胚胎。这在技术上和伦理上都比其他方法更有优势。iPSCs的建立进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离，在细胞替代性治疗以及发病机理的研究、新药筛选方面具有巨大的潜在价值。此外，iPSCs在神经系统疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈现，iPSCs在体外已成功地被分化为神经元细胞、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等，因具有与患者自身相同的基因组成，所以不会引起机体自身的免疫排斥反应。

目前iPSCs的培养和传代方法不尽相同，培养基有血清和血清替代品之分，传代方法有酶消化法和机械传代法，根据实验需求采用相应的培养和传代方法。通常的传代方式是将克隆使用Dispase或胶原酶初步处理后，使克隆变得较为松散，然后将克隆分割成克隆块以铺至滋养层细胞上的方式来传代，所用的培养条件一般为37℃，5％CO₂。该方法的缺陷是细胞易于分化，难于大规模扩增。而利用单细胞的传代方法通常会影响细胞的多能性，且长期培养对细胞核型有影响。

发明内容

针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种人诱导多能干细胞(hiPSCs)的单细胞传代及培养的方法，该方法可以迅速扩增hiPSCs，使细胞保持较好的生长状态，克服了hiPSCs易于分化、难于大规模扩增、冻存及复苏效率低的问题，易于进行核转染及单细胞克隆，为基因修饰等操作带来极大方便。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

一种人诱导多能干细胞的传代方法，该方法包括如下步骤：

A.细胞传代前1-2h铺细胞外基质到多孔板；

B.从培养箱中取出汇合率75％-85％需要传代的细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，加Accutase消化酶置于37℃、体积分数8-15％的CO₂培养箱中消化；细胞基本被消化下来时，加mTeSR1培养基终止消化；

C.离心，弃上清液，使用添加ROCK抑制剂的mTeSR1培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀记数；