[发明专利]一种人诱导多能干细胞的传代方法及应用

权利要求书

1.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

A.细胞传代前1-2h铺细胞外基质到多孔板；

B.从培养箱中取出汇合率75％-85％需要传代的细胞，用DMEM/F12培养基洗一次，加Accutase消化酶置于37℃、体积分数8-15％的CO₂培养箱中消化；细胞基本被消化下来时，加mTeSR1培养基终止消化；

C.离心，弃上清液，使用添加ROCK抑制剂的mTeSR1培养基重悬细胞，轻轻吹打均匀记数；

D.按20000-30000细胞/平方厘米的密度将细胞铺至经细胞外基质包被的培养板上，置于37℃、体积分数为8-15％的CO₂培养箱培养；

E.第二天观察细胞密度、贴壁情况，若一切正常即撤去ROCK抑制剂，换新鲜mTeSR1培养基进行培养，以后每天换液，至汇合率再次达到75％-85％既可传代或冻存。

2.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述步骤A中的细胞外基质为ECM、MatrigelLDEV-Free hESC Qualified、Vitronectin(VTN-N)或CELLstart^TMCTS^TM。

3.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述步骤B中需要传代的细胞为生长处于对数期时的细胞。

4.根据权利要求1所述的传代方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂为Y27632，HA-100，Blebbistatin或Thiazovivin。

5.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-3中任一项所述的方法，除了所述Accutase消化酶替换为胰酶。

6.一种人诱导多能干细胞的传代方法，其特征在于，该方法采用权利要求1-3中任一项所述的方法，除了所述mTeSR1培养基替换为TeSR2(StemCell，Cat#05860)，Essential8^TM Medium(Life，Cat#A14666SA)，或NutriStem(BI，Cat#05-100-1A/B)。

7.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于hiPSCs细胞大规模扩增。

8.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于高效转染hiPSCs及外源基因导入。

9.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获得单个细胞来源的克隆，以纯化细胞或筛选具有特定标记的细胞群体。

10.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获取突变体等位基因的同基因型细胞株。

11.如权利要求1-6中任一项所述的传代方法应用于获取用于基因修饰的单细胞悬液。