[发明专利]一种罗素伐他汀中间体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的生物制备方法。

背景技术

心脑血管疾病是危害人类（特别是中老年）健康最常见、最严重的疾病之一。血脂异常是动脉粥样硬化、冠心病以及其它心脑血管疾病的重要危险因素。根据近年卫生部在全国范围内进行的中国居民营养与健康状况调查显示，总患病率为18.6％，全国患者总人数达1.6亿。

调脂药可有效降低此类疾病的发生率和死亡率，对心血管疾病的防治产生积极的作用和深远的影响。他汀类药物（3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂）由于副作用较少，是目前世界上最为畅销的降胆固醇和降血脂药物。由阿斯利康(Astrazeneca)公司开发的罗素伐他汀(Rosuvastatin,英文商品名Crestor)于2002年11月首次在荷兰获批，2003年8月通过美国FDA上市审批，2009年在全球销售额44亿美元，排名第十七位。罗素伐他汀在药效和安全性方面均达到令人满意的结果，被称为“超级他汀”。

罗素伐他汀的手性侧链合成是其生产的关键步骤。(R)-3-羟基戊二酸单甲酯及其后续的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯是合成罗素伐他汀侧链的重要手性前体。利用化学方法合成(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的方法，由于条件极端且水解无选择性，极易破坏手性基团和其它活性基团，生成副产物，因此并没有得到广泛的应用。

中国发明专利公开CN101805756A公开了一种生物催化法生产他汀类药物中间体的方法，其中公开了利用消旋的4-氰基-3羟基丁酸乙酯生产(R)-3-羟基戊二酸乙酯。采取该方法，虽然能够克服化学法的不足，但是消旋体水解后得到的目标产品只有50%的理论得率，意味着一半的底物被浪费，不符合绿色化学和原子经济性的原则，而且该方法的底物投料量较低，只有20mmol/L，不具有工业应用的价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种罗素伐他汀中间体(R)-3-羟基戊二酸单甲酯和羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，实现了接近100%的转化率和高反应底物浓度。

为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：

一种(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，该方法以(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯为底物，使其在酶的作用下反应生成所述(R)-3-羟基戊二酸单甲酯，特别是，所述的酶为重组腈水解酶，该重组腈水解酶的制备方法为：将含有腈水解酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下振荡培养，培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃～-25℃，然后冷冻干燥24～48小时，即得冻干的粉状重组腈水解酶；所述的反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中以及温度25℃～35℃下进行。

根据本发明，所述的诱导剂可以且优选为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。所述的水相缓冲液可以为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。重组腈水解酶与底物的投料质量比可以为0.01～0.1:1，优选为0.02～0.05:1例如0.03:1。反应起始时，底物浓度可以为0.8～1.5mol/L，优选为1.0～1.5mol/L。

根据本发明的一个具体方面：所述方法具体实施如下：将重组腈水解酶加入到水相缓冲液中，然后采用恒流泵流加底物，待底物加毕，使反应体系在温度25℃～35℃下以及搅拌下反应，至底物转化率大于等于99.0%，终止反应。

进一步地，终止反应后，用盐酸调节体系至酸性（例如pH2～6，优选pH2～3），然后用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣；滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到黄褐色油状物即为(R)-3-羟基戊二酸单甲酯。

本发明采取的又一技术方案是：

一种羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，该羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯为(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯，其包括如下步骤：

（1）按照上述的方法制备得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯；