[发明专利]一种C3H10T1/2 中胚层多潜能胚胎干细胞株的诱导分化方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞的诱导分化方法，特别涉及一种C3H10T1/2中胚层多潜能胚胎干细胞株的诱导分化方法。 

背景技术

随着经济水平的提高、生活压力的不断加大、人们饮食结构的改变、运动量的减少，导致肥胖症的患病率迅速上升，据估计目前全世界超重或肥胖人口约达10亿。肥胖症作为代谢综合征的主要组分之一，与多种疾病如2型糖尿病、血脂异常、高血压、冠心病密切相关，严重危害人类的健康，影响和困扰着人们的日常生活。近年来研究发现，自噬在肝脏和脂肪组织的脂质代谢方面发挥着重要作用，自噬是一个吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。所以，自噬现象为肥胖症的治疗提供了新的思路。 

小檗碱是一种异喹啉类生物碱，是中药黄连的主要成分，以往研究已经证实小檗碱具有很多药理作用包括抗菌，抗肿瘤，能够抑制炎症因子TNF-α、IL-6等的表达尤其是在肥胖的个体有明显的抗炎症作用，最近的研究发现小檗碱能够降血糖，改善胰岛素抵抗作用。 

C3H10T1/2细胞系是在1973年，首次从14到17天的C3H小鼠胚胎细胞分离出来，这些细胞在培养过程中表现出成纤维细胞形态，在功能上类似于间充质干细胞，如能把C3H10T1/2诱导定向分化成前脂肪细胞，然后再按照标准的分化诱导方案分化为成熟脂肪细胞,表现出脂肪的特性，然后再应用C3H10T1/2成熟脂肪细胞来研究小檗碱对自噬的影响，监测成熟脂肪细胞中自噬对脂质代谢的调控，为肥胖症的治疗提供新的药物靶点和治疗方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种C3H10T1/2中胚层多潜能胚胎干细胞株的诱导分化方法，通过该方法，将C3H10T1/2细胞诱导分化为成熟脂肪细胞，表现为甘油三酯的蓄积和脂肪细胞标志蛋白的表达，使C3H10T1/2细胞能很好地运用到后续小檗碱抑制C3H10T1/2脂肪细胞自噬方面的研究实验中，为临床上能更合理的将小檗碱应用于肥胖患者的治疗提供依据。 

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现： 

一种C3H10T1/2中胚层多潜能胚胎干细胞株的诱导分化方法，其步骤包括： 

（1）、培养与传代：将C3H10T1/2细胞培养于培养液中，并置于5％CO₂的培养箱中培养，待细胞达80％-90％融合后加入0.25%胰酶5mL消化，细胞收缩呈圆形时加入培养液终止胰酶消化反应，离心3-5分钟、沉淀、弃去上清，再加入培养液后吹打；按1：4比例传代培养到6孔板或12孔板，置于5％CO₂的培养箱中培养，每2-4天更换培养液1次。优选的，每2天更换培养液1次。 

（2）、诱导分化：待步骤（1）中的培养板上的细胞长满后置于诱导液A中，2天后撤去诱导液A换成诱导液B，2天后撤去诱导液B换成培养液，每2-4天更换培养液1次，待90%以上细胞呈圆形并出现大量脂滴，即表示C3H10T1/2细胞已诱导成功。优选的，每2天更换培养液1次。 

所述步骤（1）或步骤（2）中的培养液为含有体积百分比为10%FBS的DMEM培养液。 

所述步骤（1）中，5％CO₂的培养箱的培养温度为35℃-40℃。优选的，5％CO₂的培养箱的培养温度为37℃。 

所述步骤（2）中，诱导液A为含有体积百分比为10%FBS的DMEM培养液，该培养液中还含有胰岛素4-5μg/mL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5-0.7mmol/L，地塞米松1-2μmol/L，吲哚美辛120-130nmol/L,三碘甲状腺氨酸1-2nmol/L，罗格列酮1-2μmol/L。优选的，所述诱导液A为含有体积百分比为10%FBS的DMEM培养液，该培养液中还含有胰岛素5μg/mL，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/L，地塞米松1μmol/L，吲哚美辛125nmol/L,三 碘甲状腺氨酸1nmol/L，罗格列酮1μmol/L。 

所述步骤（2）中，诱导液B为含有体积百分比为10%FBS的DMEM培养液，该培养液中还含胰岛素5-10μg/ml，三碘甲状腺氨酸1-3nmol/L，罗格列酮1-3μmol/L。优选的，所述诱导液B为含有体积百分比为10%FBS的DMEM培养液，该培养液中还含胰岛素5μg/ml，三碘甲状腺氨酸1nmol/L，罗格列酮1μmol/L。