[发明专利]基于探针标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的SERS方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质分析检测技术领域，具体涉及一种基于探针标记免疫金-Fe₃O₄磁性复合材料检测血清中甲胎蛋白含量的表面增强拉曼光谱（SERS）方法。

背景技术

癌症迄今仍是难以治愈的顽症之一。由于人口增长和寿命延长等因素，世界各地的癌症患者人数正逐年增长。按照目前国际医学界公认的常规疗法，治疗癌症一般需手术切除并配合进行放、化疗，然而放、化疗往往在杀灭癌细胞的同时，也严重损毁了人体多个脏器的功能。为此，科学家一直在努力寻找着更好更直接且副作用较小的方法来治疗癌症。

甲胎蛋白是单链多肽糖蛋白，分子量大约为70KD。其理化特性以及氨基酸组成与白蛋白相似。甲胎蛋白最初在胎儿的肝脏以及卵黄囊中合成。随后分泌到胎儿血清中，妊娠第13周时，达到峰值，之后逐渐降低。

肝癌是常见的造成甲胎蛋白偏高的原因之一，一般正常人血清中甲胎蛋白的含量不到20μg/L，但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生这种蛋白质的功能，据调查发现约有80%的肝癌患者血清中甲胎蛋白会升高，通常以400μg/L为标准，高于此数值应该考虑肝癌的可能性，一般在肝癌出现症状之前的8个月甲胎蛋白就已经升高，所以肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人应该根据自己的情况做定期的检查。因此，甲胎蛋白的检测对肝癌的早期诊断具有一定的参考意义。

目前，医学上检测甲胎蛋白的方法虽有许多，但都有各自的缺点和不足。比如，时间分辨荧光免疫分析法，信噪比差，检测线低；酶联免疫吸附分析法，缺少准确的定量，而且线性范围窄；放射免疫分析法，存在着放射性污染的问题。

SERS（表面增强拉曼光谱）具有超灵敏性，高选择性和检测条件温和等优点，在生物分析化学领域具有广泛的应用。与Raman（拉曼散射光谱）相比，SERS的增强因子可达10⁴～10⁷。因此SERS在痕量分析中具有很大的优势，SERS的检测限可达到ng水平，对不少化合物的检测限更低。随着理论研究的深入和实验方法的改进，SERS的灵敏度有了很大提高，尤其是利用SERS进行单分子检测，使得SERS在超灵敏分子检测中发挥着越来越大的作用，并且使SERS可以达到比荧光光谱更低的检测极限。

与本发明相近的技术是2003年9月24日公开的中国专利“表面增强拉曼散射标记免疫检测法”，公开号CN1444045A。它公开了用表面增强拉曼散射光谱检测抗原抗体特异性反应的免疫检测技术。经过形成组装体、制备SERS免疫金探针、免疫复合反应、银染色等过程，用拉曼光谱议检测标记免疫复合物。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于标记免疫金-磁性复合材料检测甲胎蛋白的SERS方法，探针标记免疫金-磁性复合材料为三明治结构，克服了传统检测蛋白质的方法在操作步骤复杂、检测效率低等方面的局限性。

本发明首先制备探针标记免疫金复合物，修饰甲胎蛋白抗体；然后，制备SiO₂包覆的Fe₃O₄磁性复合材料，浸泡到血清中，修饰上了甲胎蛋白抗原；最后，通过抗原-抗体的免疫识别捕获血清中的甲胎蛋白抗原。通过免疫金标记，检测信号被有效地放大。此外，在外磁场的诱导下，Fe₃O₄磁性纳米粒子聚集，可以提供巨大的电磁场贡献，达到对蛋白质的超灵敏检测，得到的SERS信号就更强。

本发明所述的方法，主要包含以下步骤：

(a)制备P-巯基苯甲酸（MBA）分子标记的金纳米粒子溶液，并与甲胎蛋白抗体结合，同时用BSA试剂进行封闭；

(b)制备SiO₂包覆的Fe₃O₄磁性复合材料；

(c)制备醛基化的SiO₂包覆的Fe₃O₄磁性复合材料，然后配制成PBS分散液；

(d)将一系列已知浓度的甲胎蛋白抗原的PBS溶液分别和步骤(c)的溶液等体积混合，同时用等体积的BSA试剂进行封闭；

(e)将步骤(a)溶液和步骤(d)溶液按体积比1:1混合，在37℃下温育1～2小时进行免疫反应；此时，结合在金纳米粒子上的甲胎蛋白抗体和吸附到醛基化SiO₂包覆的Fe₃O₄磁性复合材料上的甲胎蛋白抗原发生免疫反应；