[发明专利]重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用

说明书

本发明提供了一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用。上述重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法，通过使用亲和层析法将重组菌表达的可溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，尤其是将包涵体裂解，结合利用透析法和亲和层析法对包涵体中的不溶性植原体免疫主导膜蛋白进行提纯，并通过对提纯的条件和工艺参数进行优化，从而大大提高重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化效果，提纯度可达95%，而传统方法的提纯度为60%。该方法工艺简单、易于操作，并且产出量高、降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组植原体免疫主导膜蛋白的纯化方法及其应用。

背景技术

植原体(phytoplasma)是一类GC含量比较低，无细胞壁，仅有3层单位膜包被的原核微生物，专性寄生于植物和昆虫。植物染病主要症状包括丛枝、黄化、花变叶、花器退化等，由于植原体侵染性强，危害寄主广泛，曾造成许多经济作物、林木的大量死亡，带来严重的经济损失。由于植原体为无细胞壁原核微生物，尚不能在人工培养基上离体培养，给分类鉴定、传播机制、致病机制的研究带来许多困难。因为蛋白质是最终遗传信息功能的实施者，而且植原体缺乏细胞壁，其膜蛋白可以直接与植物的细胞质或介体昆虫的细胞接触，在寄主和病原的相互作用中起着重要作用。因此研究植原体膜蛋白对于建立植原体血清学检测方法，揭示植原体的进化、致病性及其与寄主的相互作用具有重要意义。

而免疫主导膜蛋白(immunodominant membrane proteins，IDPs)是大多数植原体总细胞膜蛋白的主要部分。将各组植原体的免疫膜蛋白IDPs分成三种类型：(1)免疫主导膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，代表性植原体有SPWB、AP、ESFY、PD和PYLR；(2)免疫主导膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)，代表性植原体是WX；(3)免疫抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，代表性植原体是AY和CP。1999年Michael Berg等从苹果丛枝植原体中分离出免疫主导膜蛋白(immunodominantmembrane protein，Imp)，并外源表达基因不同片段产物。研究中Berg等人分别在长春花和烟草染病植株中检测到了分子量大约为19KDa大小相似的蛋白，序列分析表明该类蛋白具有整合膜蛋白的特征，其N端暴露在细胞质一侧，一个疏水跨膜片段形成α螺旋锚定在膜中，亲水的C端暴露在细胞外。2004年，Kakizawa等人克隆了植原体Sec(细胞分泌)系统蛋白A、E、Y，且研究发现SecA有较强的免疫原性，其抗血清能检测多种植原体。但是由于不同植原体膜蛋白特异性的差异，有些膜蛋白能够在大肠杆菌体系内完整表达，有些则表达困难，且易形成包涵体，另一方面即使膜蛋白在大肠杆菌系统进行了表达，但由于膜蛋白的疏水性、溶解度等性质为后续下游分离纯化膜蛋白造成了困难。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种有效提高重组植原体免疫主导膜蛋白纯化度的方法。

本发明的另一目的在于提供一种重组植原体免疫主导膜蛋白的应用。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

获得表达植原体免疫主导膜蛋白的重组菌，诱导表达；

破碎经诱导表达后的重组菌，分离得到上清液一和沉淀物一；

将上述上清液一加入至树脂悬液与结合缓冲液混合液中，所述树脂悬液与所述结合缓冲液的体积比为1～4：1～5，在4～8℃的温度下振荡1～2小时后静置沉降，然后依次经漂洗、洗脱处理，得到可溶性重组植原体免疫主导膜蛋白溶液；