[发明专利]一株黄曲霉生防菌的抗菌活性物质及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗菌活性物质，尤其涉及来源于萎缩芽孢杆菌产生的抗菌活性物质，属于微生物学领域。

背景技术

众所周知，微生物能够产生具有抗细茵、抗真菌和抗病毒等作用的抗菌活性物质。至今为止, 青霉菌类细菌产生的青霉素、头孢霉属产生的头孢菌素、链霉菌属产生的链霉素、 四环素及红霉素等作为抗菌活性物质已经得到了广泛的利用。

然而，由于这些抗菌活性物质已经长年使用，因此普遍导致细菌对这些抗菌活性物质产生了耐受性，因此急需寻找新的、更加强有力的新型抗菌活性物质。

发明内容

针对现有技术的需要，本发明提供了一种新型的、具有良好抗菌、抑菌活性的抗菌活性物质，该抗菌活性物质来源于萎缩芽孢杆菌，本发明还提供了此种抗菌活性物质的分离纯化方法。

为了实现上述目的，本申请发明人多年来对各种杆菌进行了广泛研究，并发现从土壤中分离得到的萎缩芽孢杆菌经过培养能够得到对细菌，尤其是黄曲霉菌具有极好的抑制效果，基于此发现申请了完成了本发明。

本发明是通过下述技术方案实现的：

萎缩芽孢杆菌产生的抗菌活性物质，所述活性物质来源于下述制备方法所制备：将萎缩芽孢杆菌接种至营养肉汤培养基上进行摇床培养，将培养后的发酵液离心收集上清液，将所得上清液用过滤器过滤，即为包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液。

可以理解，本发明并不仅限于上述的抗菌活性物质，还包括包含上述抗菌活性物质的商业成品，例如抗菌剂，可以通过常规的制造方法将本发明的抗菌活性物质与医药学上已知的容许的适当医药栽体组合形成制剂，此类商业产品通常是包含食品和清洁用品的抗菌剂，例如用于化妆水、乳液、洗面奶、护肤剂、面膜、化妆油、防晒剂、木材、纸张、油性漆、布、粘合剂、涂装保护剂、食品保鲜剂 (含饮料) 、糖果、甜饼、零食等点心和辅助食品、 清凉饮料等饮料和食品中，具体的用量可以根据已有药学知识通过常规实验得到。

在上述基础上，本发明提供了所述抗菌活性物质的制备方法，包括下述步骤：1）将萎缩芽孢杆菌菌种接种至营养肉汤培养基，摇床培养即得发酵液；2）将发酵液低温下高速离心，收集上清液，用0.45um微型过滤器过滤，即为包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液。

通过上述步骤可以得到本发明的抗菌活性物质，本领域技术人员可以理解，所得到的上清液并非纯度为100%的抗菌活性物质，而是包含该抗菌活性物质的溶液，在经过更复杂的分离纯化后才能得到高纯度的抗菌活性物质。该物质含量浓度的高低只会影响用量，而不会影响单位含量物质的效力。

在上述方法中，萎缩芽孢杆菌的接种培养条件可根据需要进行调整，申请人在大量研究中得出了较为优选的培养条件：接种量：1-5%；营养肉汤培养基装液量：15-100mL/250mL；营养肉汤培养基初始pH值：5.0-9.0；培养温度：10-50℃；培养时间：12-60h；培养所用摇床转速：10-240r/min。

在上述培养条件下，所得上清液表现出一定的抗菌抑菌活性。

申请人对上述的条件进行了深入研究，发现培养温度为35℃时能有效提高抗菌活性物质的抑菌性能。

更优选的，所述步骤1）的培养条件为接种量：1.5%；营养肉汤培养基装液量：30mL/250mL；营养肉汤培养基初始pH值：7.0；培养时间：48h；培养所用摇床转速：180r/min。

在上述培养条件下，所得到的抗菌活性物质具有最佳的抑菌活性。

为了提高接种效率，在进行接种培养以前，将萎缩芽孢杆菌菌种接种到营养琼脂斜面培养基上恒温培养，加入无菌水以旋涡混合仪振荡使菌体均匀分布。

优选的，萎缩芽孢杆菌菌种接种到营养琼脂斜面培养基上，30℃恒温培养48h，所加入的无菌水含0.1%吐温-80和0.1%琼脂。

在上述基础上，本发明还公开了对所得上清液进行分离纯化的步骤，从而得到高纯度的萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质纯化物，该分离纯化方法包括下述步骤：1）将包含抗菌活性物质的去菌体发酵上清液进行粗提，粗提方法为硫酸铵沉淀法；2）包含抗菌活性物质的粗提物进行层析分离纯化，包括脱盐得到富集包含抗菌活性物质的洗脱液和将脱盐所得洗脱液进行离子交换层析将所得流出液收集、合并，浓缩得到萎缩芽孢杆菌抗菌活性物质纯化物的步骤。

优选的，上述步骤1）采用硫酸铵沉淀法：将发酵上清液加入硫酸铵固体粉末至80%饱和度硫酸铵，离心收集沉淀。