[发明专利]对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种侧孢芽孢杆菌的筛选方法，特别涉及一种对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法。

背景技术

侧孢芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）是一种好氧的产孢细菌，可以产生舟形内含物，属于芽孢杆菌属，革兰氏染色阳性，可变为阴性。侧孢芽孢杆菌是经国家农业部微生物检测中心批准使用的一种天然菌种。可用于土壤微生物肥料和生产养殖上。例如：中国专利文献CN101200385A、CN101200387A、CN101462901A和CN1966670A公开了利用侧孢芽孢杆菌制取微生物有机肥料，能够明显抑制有害病菌病毒的生长繁殖，增强作物根系活力，促进作物生长，对减少化肥农药用量、保护环境有明显作用。但是，如果将侧孢芽孢杆菌与化肥一起使用，化肥中的无机盐将会使得侧孢芽孢杆菌不能存活下来，失去了其微生物肥料的作用。

发明内容

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，提高侧孢芽孢杆菌对磷酸二氢铵的耐受能力。

本发明的技术方案是这样实现的：对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）分离基础培养基的制备；

（2）灭菌；

（3）复壮；

（4）筛选；

（5）驯化。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（1）中，基础培养基采用营养琼脂培养基。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（1）中，营养琼脂培养基的组成如下：7-13克蛋白胨，0.5-5.5克牛肉粉，0.1-0.9克ZnSO₄，0.1-0.9克Na₂B₄O₇.10H₂O，0.2-1.8克黄腐酸钾，1-9克磷酸二氢铵及700-1300mL水；制备好的营养琼脂培养基的pH为7.3±0.1。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（2）中，营养琼脂培养基经过高温灭菌，灭好菌的营养琼脂培养基倒平板准备培养皿，试管培养基摆斜面制备营养琼脂试管斜面，冷却，备用。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（3）中，超净工作台开紫外灯灭菌，实验室甲醛熏蒸，吸无菌水加入冻干管中，将侧孢芽孢杆菌菌种干粉做成菌悬液，在火焰封口的状态下倒入步骤（2）中制备好的营养琼脂试管斜面上，将菌悬液平铺在斜面培养基上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（4）中，在菌种操作间，将超净工作台开紫外灯灭菌，进行无菌操作，用接种针在步骤（3）中培养好的试管斜面菌种挑起菌落，在步骤（2）中准备好的培养皿中划线，将划好线的培养皿放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，观察是否有典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落形成；将典型的侧孢芽孢杆菌的单菌落，转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上，放入恒温培养箱中34℃±0.5℃，培养3—5天，待用。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（5）中，按照磷酸二氢铵质量分数为0.5-3.5%、3.6-6.5%、6.6-9.4%、9.5-12.5%、12.6-15.5%、15.6-18.5%、18.6-21.5%和21.6-24%在营养琼脂培养基里相应增加磷酸二氢铵的浓度，分别制备成培养皿；在步骤（4）中培养好的营养琼脂试管斜面上，挑菌种首先在磷酸二氢铵质量分数为0.5-3.5%的培养皿划线培养，将培养的单菌落转入步骤（2）中准备好的营养琼脂试管斜面上培养，培养结束后作为菌种在下一个磷酸二氢铵浓度的培养皿中划线培养，依次类推。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（4）和步骤（5）中，开紫外灯灭菌至少30分钟。

上述对磷酸二氢铵耐受的侧孢芽孢杆菌的筛选方法，在步骤（5）中，按照磷酸二氢铵质量分数为3%、6%、9%、12%、15%、18%、21%和24%在营养琼脂培养基里相应增加磷酸二氢铵的浓度，分别制备成培养皿。

本发明中涉及的侧孢芽孢杆菌的原始来源：CGMCC1.0864，【菌株历史】←中国科学院微生物研究所，中科院菌种保藏中心购买。

本发明的有益效果是：本发明筛选方法得到的侧孢芽孢杆菌对磷酸二氢铵的耐受能力有显著提高。

具体实施方式

实施例1