[发明专利]一种激活标签Ac/Ds转座系统及其在植物突变体库构建中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及该新型激活标签Ac/Ds转座系统的构建及其在植物突变体库创建中的应用。

背景技术

随着多种植物全基因组测序工作的陆续完成，以寻求基因功能为目标的植物后基因组学时代已经到来。面对这些基因组测序工作中产生的海量的数据和资源，如何发现新基因、认识基因功能并了解所有基因在植物生长发育过程中如何协调发挥作用成为功能基因组学研究最为紧迫的任务。要精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用，必须分析单个基因和多个基因的突变表型，通过突变体表型来分析鉴定基因功能。而获得足够数量突变表型的最直接有效的方法即是构建饱和基因突变群体，因此突变体库的构建是功能基因组学研究的基础。

传统创建突变体库的方法有自发突变和理化诱变等方法。通过寻找自发突变体的方法来创建突变体库，已经无法满足大规模、高通量的全基因组序列研究的要求。而通过理化诱变获得突变体的方法，由于诱变过程不易控制，一个突变体经常包含多个突变位点，增加了功能基因鉴定的难度，极大地限制了其在功能基因组学中的广泛应用。随着农杆菌介导的植物转基因技术的不断完善，T-DNA插入方法已成为许多植物快速构建插入突变体库的主要方法，如水稻，拟南芥等。T-DNA在外源植物因组中的整合是随机的，它可以整合到植物的任何一条染色体上，T-DNA插入位置不同，引起植物表现不同表型，从而产生不同的突变体。但利用T-DNA插入技术构建饱和突变体库，需要成熟和高效的遗传转化技术，需要拿到成千上万的转基因植株。目前许多作物都不具备这些条件，且工作量巨大，需要投入大量人力物力，因而限制了这种突变体库创建方法的广泛应用。

转座子（transposon, 简称Tn），又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA顺序。研究者们利用转座子可以在植物基因组中不断跳跃产生突变的特点，来构建植物基因组的饱和突变体库。玉米Ac/Ds (activator/dissociation) 转座子系统是植物体内第一个被发现的可移动的遗传元件，是美国学者McClintock在研究玉米染色体重排和断裂时发现的，于1983年被克隆。1986年，Baker利用农杆菌介导的方法将Ac/Ds转座子系统引入烟草中，首次证明该转座子系统可以在转基因烟草中发挥作用，开启了Ac/Ds转座子系统在异源植物中的应用研究。研究者们利用Ds转座元件可以在植物基因组中不断跳跃产生突变的特点，来构建植物基因组的饱和突变体库，如水稻Ac/Ds突变体库的构建和拟南芥Ac/Ds突变体库的构建。利用Ac/Ds转座系统标签法构建的突变体库既具有T-DNA插入突变体库信息量大的优点，又可通过转座子自身在植物基因组中的移动不断获得新的转座事件。对于转化效率不高的植物，只要产生少量的转化株，就可以通过转座不断获得更多新的突变体株系，大大节省了进行人工转基因的工作量。转座子元件这些重要特点使转化效率不高的植物构建大规模的插入突变体库成为了可能。但是，Ac/Ds转座子系统导致的突变绝大多数为隐性突变，即无表型突变，又称功能失去型（loss-of-function）突变。这种适用于二倍体植物的突变体创建方法，在多倍体作物中受到了极大的限制，因为对多倍体植物如棉花、小麦、油菜等来说，通过隐性突变发现突变体的几率极低，这无疑增加了功能基因鉴定的难度，成为该系统广泛应用的一大障碍。而激活标签技术的出现和应用，为解决这一难题提供了有效手段。

激活标签技术是指将增强子或强启动子随机插入植物基因组，使得增强子或强启动子插入位点侧翼原先不表达或弱表达的基因得到过量表达，从而产生显性的功能获得性突变体。如前所述，以T-DNA为基础的激活标签技术需要大量繁重的组培转化工作，以得到数以万计的转基因植株，工作量非常巨大，对遗传转化技术不成熟及基因组比较庞大的作物而言更是困难重重。

发明内容

本发明的目的在于提供一种转座系统，插入位点临近基因的突变率高，且特异性高。

本发明的目的是通过以下措施实现的：

一种Ac/Ds转座系统，包括转座酶Ac载体、转座子Ds载体，其特征在于所述转座子Ds载体带有激活标签，所述激活标签为4个串联的35S增强子（4×35S），4×35S增强子置于Ds3’端内侧。

为了准确的识别、克隆突变基因，上述转座子Ds载体，还包括pBluescript II SK(+)质粒片段,pBluescript II SK(+)质粒片段位于4×35S增强子的下游。pBluescript II SK(+)质粒片段是pBluescript II SK(+)质粒切除多克隆位点后的剩余片段。