[发明专利]利用防腐剂提高农杆菌介导的小麦转化存活率的方法

说明书

技术领域

本发明属于小麦转基因领域，涉及利用防腐剂提高农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦存活效率，进而提高转化效率的方法。

背景技术

小麦是总产量居第二位的重要粮食作物，世界各地广泛种植。随着世界人口的增长和人们生活水平的提高，对小麦的需求量越来越大，对小麦品质的要求也越来越高，常规育种已不能满足人们对小麦品种和品质的要求。转基因技术的发展打破了常规育种的种族限制，许多作物诸如玉米、油菜等利用转基因技术已经成功培育出了优质、高效的转基因新品种。与其他作物相比，小麦的转基因育种相对滞后，转化成功的例子较少，一方面，由于小麦组织培养植株的再生频率低，建立稳定高效的再生体系比较困难；另一方面，小麦是多倍体作物，基因组大，遗传背景复杂，遗传转化体系不完善。目前，小麦转基因的方法主要有基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法以及花粉管通道法。

基因枪法是小麦转基因育种的主要方法，在获得的小麦转基因植株的报道中，基因枪法占了绝大多数，这主要由于该方法不受作物基因型的限制、方法相对简单，目前基因枪介导的小麦转化体系已经比较完善。但是基因枪法成本花费高、周期长，不利于转基因小麦的产业化。PEG法主要是以原生质体为受体的转化方法，由于小麦的原生质体再生困难，限制了该方法的使用。花粉管通道法是利用植物授粉后花粉萌发形成的花粉管，将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中。该方法具有操作简单、耗费低廉、不需要经过繁琐的组织培养过程等优点，但是目前该方法尚不成熟，DNA的导入时间和部位往往会影响植株的结实率，最终很难得到转基因后代。由于小麦不是农杆菌的天然宿主、谷类作物对农杆菌没有伤感反应等原因，农杆菌介导的小麦转化一直是摆在分子生物学家和育种家面前的一道难题。后来人们虽然实现了农杆菌介导的小麦转化，但是受到基因型、组织培养条件、外植体类型、农杆菌菌株等限制，目前农杆菌介导的小麦转化效率低，需要通过组织培养和植株再生阶段，周期比较长，不利于产业化的发展。农杆菌介导的活体转化方法不需要经过复杂的组织培养和植株再生阶段，不仅具有农杆菌介导转化的通用优点，而且具有很高的实际操作性。

但是在运用纵切小麦幼苗叶基座进行农杆菌转化时，共培养过程中霉菌的大量生长导致小麦转化苗绝大部分死亡，此种现象很普遍，这样严重影响了转化效率。因此，本发明在进行农杆菌介导的小麦纵切幼苗叶基座转化时，在共培养基质中添加防腐剂遏制了霉菌的生长，提高转化植株存活率，由41%-47%提高至91%-94%，具有很高的实际操作性和市场推广价值。

发明内容

本发明旨在提供一种新的纵切幼苗叶基座转化小麦的方法，包括以下步骤：

（1）挑选合适的小麦种子，剔除瘪小的，用自来水清洗，吸水饱和，发芽的幼苗作为转化供体；

（2）将含有目的基因的农杆菌YEB平板培养基划线活化，挑单菌落摇菌，取适量菌液涂板，玻璃涂棒刮下农杆菌用加入了As（200μM）； KT（0.2mg/L）； 2,4-D（1mg/L）；DTT（2mM ）；SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基悬浮，使悬浮菌液的OD₆₀₀值约为1，pH至5.5，所得液体为转化液；

（3）转化液侵染小麦幼苗叶基座；

(4)共培养基质的制备：

A、每升蛭石中事先添加丙酸钙1.5-3g；

B、加入了As（200μM）、 KT（0.2mg/L）、 2,4-D（1mg/L）、DTT（2mM ）、SIlwet-L77（200μl/L）的基本液体培养基中再加入防腐剂苯甲酸钠0.1-1g/L、山梨酸钾1.0-5.0 g/L、尼泊金酯0.01-1.0g/L；

C、将A和B混匀至湿度为70-80%，混匀后的基质即为共培养基质。

（5）转化结束后将幼苗埋入共培养基质中进行共培养，然后定植到大棚中培养。 

含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于：pKT系列载体、pWM系列载体、pBn系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于：AGL0、AGL1、GV3101、EHA105、LBA4404等。

本发明中所述的小麦为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料。

本发明在农杆菌介导的纵切幼苗叶基座转化小麦的过程中在共培养阶段添加防腐剂后提高了转化小麦的存活效率，存活效率由41%-47%提高到了91%-94%，同时，所述防腐剂本身价格低廉，用量小成本低，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。