[发明专利]猪α-干扰素复合制剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种猪α-干扰素复合制剂的制备方法。

背景技术

我国是世界养猪最多，同时也是猪病最多、最复杂的国家。目前，猪的重要传染病的控制不力仍然是养猪业面临的主要难题。在猪的重要传染病中病毒性疾病尤其是猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪伪狂犬、猪细小病毒病、猪瘟、猪流感等造成的经济损失无法估量。对于这些常见的病毒病，虽然可用疫苗作常规免疫，但由于免疫程序、疫苗本身和动物个体等种种原因，使其在实际生产中的效果不尽人意，且弱毒疫苗的应用具有返祖的潜在危险，并可干扰传染病的诊断。因此，研制安全、高效的抗病毒制剂和免疫增强剂来增强动物抗病力和提高现有疫苗的保护率具有重要现实意义。

猪α-干扰素（IFN-α）作为一种有效抗病毒细胞因子，能迅速干扰病毒的复制，有效地防止传染病的发生，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统之一。目前，利用基因工程技术研制和开发的重组猪IFN-α已上市，在临床实践中具有良好的应用效果。猪IFN-α即可抑制多种RNA病毒的复制，又可抑制多种DNA病毒的复制。临床应用表明猪IFN-α具有显著的抗病毒功能，对于猪的多种病毒性传染病，如流行性腹泻、猪瘟、蓝耳病、传染性胃肠炎等都有一定防治效果。然而，猪IFN-α作为一种糖蛋白细胞因子，易于被胃蛋白酶消化，因此只能通过肌肉注射途径给药，无法通过口服方式给药，这就为猪群爆发严重传染性疾病时采取全群给药方式带来困难。因此，在改进猪IFN-α给药途径方面进行发明尤为必要。

干酪乳酸杆菌是存在于人和动物肠道内正常的益生菌，是一种公认的具有GRAS（Generally Regarded As Safe)有益微生物，拥有天然的抗菌作用。乳酸杆菌是至今发现的唯一没有致病性的一个菌种，一些经过筛选的干酪乳酸杆菌株可直接口服，能够耐受胃液中的强酸和小肠上段的胆盐，因此干酪乳酸杆菌作为一种口服递送载体来运送外源蛋白，而且干酪乳酸杆菌在人和动物体内占绝对优势，以它为表达系统作为口服递送载体较其它菌株更易达到较高的表达量。此外，乳酸杆菌菌体本身就对机体有益生作用，其分泌多种物质更是机体必不可少的，若再在其载体上克隆入外源目的基因，这样就可集菌体、自泌物质和外源蛋白于一体；若选择非抗性标记，则该表达系统中的菌体、选择性标记、诱导物均为食品级，为生产绿色安全的生物制品提供了可能。减少对抗生素的应用，生产绿色畜禽产品是畜牧业发展的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪α-干扰素复合制剂的制备方法。

本发明的技术方案是：一种猪α-干扰素复合制剂的制备方法，它的步骤如下：

（1）人工合成150bp的短小乳酸杆菌信号肽序列，包括SP上游的酶切位点NdeⅠ及下游的酶切位点，下游的酶切位点依次为KpnⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、XbaⅠ、SalⅠ、Pst I、SphⅠ、Hind Ⅲ和EcoR I，并克隆到PUCK载体，构建出pUCK-SP载体；

（2）通过PCR方法从 pMD18-IFN-α载体上扩增出501bp的猪IFN-α基因序列，并插入pUCK-SP载体的KpnⅠ和EcoR I酶切位点，构建出pUCK-SP-IFN-α质粒，pUCK-SP-IFN-α质粒经NdeⅠ和EcoR I酶切，回收SP-IFN-α片段；

（3）根据Genbank发表的干酪乳酸杆菌乳糖操纵子基因序列，设计1对特异引物，上游引物5’端加入PstⅠ酶切位点，下游引物5’端依次加入KpnⅠ、NdeⅠ酶切位点，利用PCR方法从干酪乳酸杆菌基因组DNA中扩增出298 bp乳糖启动子plac序列，利用T₄DNA连接酶把乳糖启动子片段和SP-IFN-α片段连接，然后使用乳糖启动子上游引物和猪IFN-α下游引物通过PCR扩增串联出plac-SP-IFN-α片段，将plac-SP-IFN-α片段连接到穿梭载体pIAbeta8，转化DH5α感受态细胞，构建干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8-plac-SP-IFN-α；

（4）通过电转化方法，把干酪乳酸杆菌复制型表达质粒pIAbeta8-plac-SP-IFN-α转进干酪乳酸杆菌感受态细胞，在氯霉素固体培养基上培养48小时，筛选出阳性菌株，然后，用溶菌酶破壁方法提取阳性菌株质粒，得到猪α-干扰素复合制剂。