[发明专利]一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗生素阿里沙霉素（alisamycin）的制备方法，尤指一种从三泽链霉菌株(Streptomyces misawanensis)D35中分离纯化阿里沙霉素（alisamycin）的方法。

背景技术

目前对植物病害的防治主要采用化学农药。化学农药防治虽然发挥了重要作用并取得了明显的成效，但化学农药的广泛、大量和长期使用已经给人、畜健康等带来了不良影响，特别是化学农药对人畜的毒副作用和残留问题至今未得到有效解决。致此，用微生物的代谢产物来防治植物病害迅速得以发展。

放线菌是一类极其丰富的微生物资源，也是产生抗生素活性物质最多的一类微生物，迄今已知的抗生素中，有2/3是由放线菌产生的。不少抗生素已用于防治农作物上的有害生物，如井冈霉素、春雷霉素等用于防治植物真菌性病害。而放线菌中的链霉菌属能产生多种抗生素物质，该些抗生素物质对植物病害的生物防治具有周期短、易于研究、便于生产、无毒无害等优点，对用于植物病害防治有广阔的前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，是以三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35为发酵菌株，从中分离纯化阿里沙霉素（alisamycin）的方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种以链霉菌提制阿里沙霉素的方法，该方法包括如下步骤：

A、以三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35作为发酵菌株，制备发酵液；

B、除去发酵液中的菌丝体，再采用乙酸乙酯进行萃取，得粗提液，将该粗提液在70℃真空浓缩得粗提取物；

C、将上述浓缩的粗提物上硅胶柱进行三次柱层析，第一次柱层析用乙酸乙酯作洗脱剂，第二次柱层析用乙酸乙酯和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，第三次柱层析用石油醚和丙酮的混合洗脱液进行梯度洗脱，并经薄层点板合并活性组分；

D、将上述活性组分采用制备型高效液相色谱进行纯化，得单体化合物，色谱条件如下：制备型色谱柱:XTerraPrep MS C₁₈Column10um,7.8×300mm，采用体积比乙腈：水：乙酸=45：55：0.5为流动相，柱温为35℃，流速为7mL/min，保留时间为30min，检测波长为279nm，进料量100μL；

E、采用核磁共振氢谱及核磁共振碳谱技术对上述单体化合物进行结构鉴定，该单体化合物为阿里沙霉素。

上述提及的三泽链霉菌(Streptomyces misawanensis)D35（保藏号为CGMCC NO.3250），在申请号为201010001144.0的中国专利申请中已有详细描述。

上述步骤A中的发酵液是挑取在高氏一号斜面培养基上新鲜培养的三泽链霉菌株D35的孢子接种到种子培养液中，28-30℃，转速为180-250r/min预培养24-32h后，按5-10%的接种量转接到发酵培养基中，27-31℃，转速为180-250r/min震荡培养72-84h制得。

上述提及的高氏一号斜面培养基为现有常用培养基，上述种子培养液和发酵培养基配方为：可溶性淀粉20g、KNO₃1g、K₂HPO₄1g、NaCl1g、CaCO₃4g及蒸馏水1000mL，pH7.2。

上述步骤B中粗提液是于室温下，将乙酸乙酯与发酵液按2:1的体积比混合，静置分层，收集萃取相得到。

上述步骤C中第二次柱层析进行梯度洗脱时的乙酸乙酯和丙酮的体积比为8：1、6：1和2：1。

上述步骤C中第三次柱层析进行梯度洗脱时的石油醚和丙酮的体积比为4：1、3：1和2：1。

与现有技术相比，本发明的优点：选择性强、操作简单、提取效率高、提取速度快、产品质量好等优点。

具体实施方式

三泽链霉菌株D35发酵液的制备：

挑取在高氏一号斜面培养基上新鲜培养的三泽链霉菌株D35的孢子接种到种子培养液中，28℃，转速为200r/min预培养30h后，按8%的接种量转接到发酵培养基中，27℃，转速为200r/min震荡培养72h。

发酵液的预处理，萃取和活性物质的粗提：