[发明专利]光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜及试验方法

说明书

技术领域

    本发明涉及生物化学试验领域，特别是一种光激活显微跟踪监测系统。

背景技术

在生物、化学等科学领域中，在分子水平跟踪监测生物化学反应和信号发生过程有着重要的意义和作用，因为可以避免多步反应过程中多个分子同步的困难，也可以避免大量分子的复杂而不易调控的相互干扰，同时其获得的更为详尽的结果是常规体检测技术得不到的。单分子荧光技术通常利用发光分子/基团来定位跟踪单个目标分子， 探索生物化学过程的详尽信息，因而在生物、化学、材料等研究领域都有着广泛的应用。

然而单分子荧光技术的使用多局限于分子定位并跟踪其位置的变化，或者分子的旋转/空间构型变化，或者利用其自相关性来研究生物化学反应的平均动力学行为。在单分子水平上直接观测生物化学反应的动力学过程却一直是个难题，因为生物化学反应要求反应分子的浓度有个低限，而在这个浓度下荧光标志的目标分子往往会带来过高的背景荧光而使得观测单个荧光分子的发光无法实现。

光激活定位显微技术利用光激活荧光基团/分子的光激活特性，通过控制激活光的强度和开关以控制光激活荧光基团/分子的发光与否，然后使用成像光激发激活态荧光基团/分子发出荧光，而未被激活的其它荧光基团/分子则不会发荧光。这样每次仅激活有限数目的荧光基团/分子来降低实际发光分子的浓度，从而使这些分子相距光学显微镜的分辨率来分别单个分子的荧光，并用点扩散函数来定位每个分子。因而，光激活定位显微技术适用的样品往往是固定的样品并需要多次成像才能得到一幅完整的分子高分辨分布图。

然而，在单分子水平上直接观测化学反应及蛋白质间相互作用（与生物体内信号发生过程密切相关），并捕捉其详尽的动力学机制，技术的实现仍很困难，缺乏较普适的手段。

发明内容

本发明创造的目的是提供一种在分子水平监测生物化学反应的装置。

为实现本发明创造目的而采用的技术方案是这样的，一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学显微镜，包括样品台、显微镜物镜、成像激光发射器、相机和激活激光发射器。所述样品台的上表面承载透光衬底，所述样品台具有一个贯通上下表面的通孔，所述透光衬底覆盖在所述通孔上。所述透光衬底的上表面承载着相互接触时会发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B，其中，所述物质分子A被固定在透光衬底的上表面，而物质分子B本身是可激活荧光分子或用可激活荧光基团标记了，实验前，物质分子B溶解或悬浮在溶液中，实验中，将物质分子B滴加到物质分子A中。所述透光衬底下方安装显微镜物镜，所述显微镜物镜下方安装相机。所述显微镜物镜的前透镜面向透光衬底的下表面，所述显微镜物镜的主轴延长线与透光衬底的上表面交点为o点。所述成像激光发射器发射出的成像激光束和激活激光发射器发射出的激活激光束汇聚成一路光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点。

值得说明的是，本发明所涉及的发生生物化学反应的物质分子A和物质分子B即为实验目标反应的分子/生物大分子，在实施例部分有若干举例。将其中一种分子/生物大分子固定在透光衬底的上表面，即将其稀疏地连在透光衬底表面，连接方式可以采用一些常用的生物化学方法。本发明中，参与目标反应的一种分子/生物大分子在激活激光束照射较短时间（比如10微秒）后会发出荧光；或参与目标反应的一种分子/生物大分子在用可激活荧光基团标记后，再在激活激光束照射一定时间后会发出荧光。而该分子/生物大分子在不被激活激光束照射或过短时间（比如少于10微秒）照射均不会发出荧光。

本发明中，汇聚成一路光束的成像激光束和激活激光束后，以大于临界角的入射角射入所述o点，即是使其在透光衬底与透光衬底表面溶液（物质分子A和物质分子B的反应溶液）的接触界面发生全反射。所述临界角即为光线从透光衬底（光密介质）射向透光衬底上表面溶液（光疏介质）时，刚好发生全反射的入射角。即激活激光束只能够照射到透光衬底上表面的、参与目标反应的分子/生物大分子溶液的底部浅层（厚度约为100～300nm）。

本发明由于具有上述结构特征，可以用其进行生物化学反应动力学实验。即本发明的另一个目的是提供一种光激活单分子荧光生物化学反应动力学试验的方法，包括以下步骤：

1）将参与目标反应的物质A固定到透光衬底的上表面。即将其稀疏地连在玻璃透光衬底表面，连接方式可以采用一些常用的生物化学方法。