[发明专利]一种雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体的，本发明提供了一种雌二醇（Estradiol）纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

雌二醇（E₂），雌激素主要来源于卵泡内膜细胞和卵泡颗粒细胞。在卵泡发育过程中，先经促黄体生成素（LH）刺激卵泡内膜分泌睾酮，再经颗粒细胞在促卵泡激素（FSH）刺激下转化为雌二醇，雌二醇是妇女体内生物活性最强的雌激素。雌二醇值增高的病理病因1）卵巢疾患：卵巢颗粒层细胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪样细胞瘤、性激素生成瘤等，均表现卵巢功能亢进，雌二醇分泌量增加。2）心脏病：心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉狭窄。3）其它：系统性红斑狼疮、肝硬化、男性肥胖症。雌二醇降低的病理原因1）卵巢疾病：卵巢缺如或发育低下，原发性卵巢衰竭、卵巢囊肿。2）垂体性闭经或不孕。3）其它：甲低或甲亢、柯兴氏综合征、阿狄森氏病、恶性肿瘤、较大范围的感染、肾功能不全、脑及垂体的局灶性病变等。

目前常用的检测雌二醇的方法有：

（1）放射免疫分析技术（RIA）：较早的临床定量检测方法，灵敏度高，特异性高，但因为有放射性污染，且操作繁琐，市场逐渐萎缩。

（2）酶联免疫分析法（ELISA）：RIA之后出现的分析方法，因操作简单，无放射性污染，价格较低，现在有一定的市场占有率，但ELISA灵敏度不如RIA。

（3）化学发光免疫分析（CLIA）：CLIA为当今最为敏感的微量免疫测定法，具有灵敏度高、稳定性好，无污染等优点，目前以广泛应用到基础和临床医学的各个领域，但是多以化学发光板为载体，检测的灵敏度和准确度还是不高。

目前已有多件磁微粒化学发光方法检测雌二醇的专利申请，如申请号（200910200391）的专利申请是化学发光板的方法，板间差异较大，申请号（201110227587和201110257932）的专利申请使用的是微米级磁微粒，检测灵敏度较低。

发明内容

本发明要解决的问题是提供雌二醇的化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法，避免了放射性免疫分析的试剂有效期短、存在放射性污染、操作繁琐等缺点，且解决了灵敏度低，检测范围窄，成本高的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：雌二醇纳米磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒，包括：雌二醇校准品；偶联有链霉亲和素的纳米磁微粒悬浮液；生物素标记的雌二醇抗体；雌二醇酶结合物，所用的酶为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶纯度RZ≥3.0，活性≥250U/mL；雌二醇质控品；化学发光液A液和B液；20倍浓缩洗液；反应管。

进一步，所述的发光液A液的主要成分为鲁米诺，B液的主要成分是过氧化脲；A液中鲁米诺的质量-体积浓度为0.7g/L，B液中过氧化脲的质量-体积浓度为0.675g/L。

进一步，所述的纳米磁微粒是表面包裹带有氨基或羧基活性基团的四氧化三铁，粒径0.3-0.5um。

进一步，所述的雌二醇质控品包括低值质控品和高值质控品，低值质控品的浓度是10pg/mL、高值质控品的浓度是500pg/mL。

进一步，所述的反应管的材料是透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或玻璃。

试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

（1）雌二醇校准品的配制：

将雌二醇抗原用含1%牛血清白蛋白（BSA）的校准品稀释液配制成校准品浓储液，以国家校准品进行定标，将校准品浓储液用校准品稀释液稀释至工作浓度，分别为0，30，100，300，1000，3500pg/mL；

（2）雌二醇质控品的配制：

用校准品稀释液将上述（1）配制的校准品浓储液分别稀释至10pg/mL和500pg/mL；10pg/mL作为低值质控品，500pg/mL作为高值质控品；

（3）纳米磁微粒-链霉亲和素悬浮液的制备，配制1L：

A、四氧化三铁纳米磁微粒制备

采用沉淀法制备四氧化三铁纳米磁微粒，具体制备方法如下：1）将FeCl₃·6H₂O和FeCl₂.4H₂O以摩尔比2：1加入到蒸馏水中，剧烈搅拌溶解；2）在氮气氛下加0.5M氨水于上述铁盐溶液中，调pH9-10，反应温度65℃，反应时间45min；3）反应结束后，用蒸馏水洗涤至中性，弃上清，于60℃烘干，即得10-50nm的四氧化三铁纳米磁微粒；

B、纳米磁珠表面羧基的偶联