[发明专利]猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物传染病学检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和在猪流感病毒H3亚型抗原体外检测中的应用。

背景技术

猪流感病毒（SIV）可以感染人，并且可致人死亡。最早有SIV报道的是在1918年西班牙大流感时，当时报道的流行地区主要有匈牙利、美国及中国。在上个世纪，流感约引起0.2-0.4亿人死亡，这可能是由AIV和人流感病毒基因发生重组引起的。

目前在猪群中主要是H3N2、H1N1、H1N2三个亚型的猪流感病毒流行，当然也有从猪身上分离到H9N2、H1N7、H3N1、H5N1、H2N3、H3N6及H4N6的报道。猪流感病毒的宿主很广泛，可以感染猪、水貂、马、人、鸟类等。猪流感一般有两种流行方式:一种是全球大流行，感染猪呈现不明显的临床症状，发病率高，可达100%；另一种是地方流行，病毒快速在一个小区域内传播，在没有继发感染的情况下，病猪很快康复。

免疫胶体金技术大量应用于快速检测病毒抗原及抗体中。胶体金技术自1971年人类首次利用胶体金建立检测沙门氏菌的胶体金检测方法以来，得到了快速的发展。胶体金发展到投射电镜、彩色免疫金银染色、蛋白质转移电泳、扫描电镜等领域。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒及其制备方法和应用。

上述目的是通过以下技术方案实现的：

申请人通过对实验室现有的及NCBI在1990-2011年间收录的猪流感病毒H3亚型的血凝素蛋白序列进行进化分析，筛选出两株实验室现有的猪流感病毒H3亚型毒株GD3、HN3作为免疫原，用HI方法筛选，得到4株能分泌抗猪流感病毒H3亚型血凝素蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3D1、2B8、4H9、1F6，于2013年5月22日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号依次为CCTCC NO：C201374、CCTCC NO：C201375、CCTCC NO：C201376、CCTCC NO：C201377。经试验测定，此4株单克隆抗体只与猪流感病毒H3亚型发生反应，而不与其他亚型的流感病毒发生反应，具有良好的特异性。

一种猪流感病毒H3亚型胶体金检测试剂盒，包括检测试纸，所述检测试纸包括PVC底板、滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、免疫胶体金垫、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于PVC底板上，所述免疫胶体金垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9，所述免疫硝酸纤维素膜上设有包被有单克隆抗体1F6和3D1的检测线和包被有抗鼠IgG抗体的质控线。

申请人用该试剂盒检测200份猪临床肺脏样品，检出了7份阳性肺脏样品，对检测样品进行病毒分离证明其特异性为100%。用此试剂盒对引起猪常见病毒病的病原进行检测，如PRV、PCV2、PRRSV、CSFV，结果显示均为阴性；并且用此试剂盒对其它亚型的流感病毒进行检测，如：H1亚型、H5亚型、H9亚型、H10亚型的流感病毒，结果显示均为阴性。此试剂盒具有操作简便、特异性强、灵敏度高、稳定性高等优点。

所述的免疫胶体金垫可参考以下方法制备得到：

1）胶体金的制备：量取120mL超纯水加入到250mL蓝盖瓶中，然后加入1%氯金酸1.0mL，轻轻盖上瓶盖（保证能透气，别拧紧）于微波炉中加热至沸腾，迅速加入1.8mL 1.0%的柠檬酸三钠，继续加热10分钟。室温冷却，加入超纯水定容至100mL, 4℃保存备用。

2）胶体金标记的单克隆抗体2B8和4H9的制备：取胶体金溶胶100mL，调pH至9.0，放在磁力搅拌器上边搅拌边加入适量纯化后的单克隆抗体2B8或4H9，搅拌90min,然后加入终浓度为1%的PEG20000, 继续搅拌60min。将标记好的金标复合物于4℃以3000r/min离心12min，弃沉淀，上清在4℃以8000r/min离心30min，弃上清，用10mL金标抗体保存液重悬沉淀。

3）所述的金标抗体保存液配方：20mMTris-Cl、5%海藻糖，调pH至9.0。

4）胶体金垫处理液的制备：20mMTris-Cl、1%PVP-40、0.5%Trion-100，调pH至9.0。

5）胶体金垫处理：将胶体金垫浸泡在胶体金垫处理液中4℃过夜，37℃烘干，将金标抗体涂布在已预处理的胶体金垫上，置于干燥机中抽干，4℃干燥保存。

所述的滤样纸按以下方法制备：