[发明专利]一种保持高细胞活率的神经干细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域。具体来说，涉及一种神经干细胞的培养方法。

背景技术

对于包括帕金森病、Alzheimer's病、脑卒中、恶性神经胶质瘤及中枢和外周神经损伤等神经系统疾病，长期以来均缺乏有效的治疗手段。常规临床治疗方法主要是以减少或防止继发性损伤为主，基本上没有治愈的可能。自上世纪90年代神经干细胞的发现，对上述神经系统疾病的治疗带来了希望。

神经干细胞具有自我更新、自我复制的特性。目前已在多种动物模型及人体中尝试过将神经干细胞移植到纹状体等脑神经病变部位及受损伤的脊髓中，并获得一定疗效。但要广泛地开展神经干细胞治疗神经系统疾病，神经干细胞的来源和数量仍是制约其广泛应用于临床治疗领域的主要难点。

对于神经干细胞的提取、培养、纯化、诱导等方面已积累了一定的经验。目前，神经干细胞的培养主要以悬浮培养为主，神经干细胞以神经干细胞凝集体，即神经细胞球的方式扩增。但是，随着神经细胞球培养时间的延长以及神经细胞球的扩大，营养物质通过渗透方式进入神经球内营养神经干细胞的途径不断加长，神经干细胞获得营养供应越来越困难，结果导致神经干细胞的大量凋亡或死亡，神经干细胞的整体活率低。

因此，建立一种保持高细胞活率的人神经干细胞的培养方法，是目前亟待解决的问题。

发明内容

根据本发明的一方面，本发明提供一种神经干细胞的培养方法，其包括步骤：

1）提供神经干细胞；

2）对神经干细胞进行悬浮培养，然后将经过悬浮培养的神经干细胞进行贴壁培养；

3）重复1次或多次步骤2）；

4）收获神经干细胞。

在悬浮培养和贴壁培养的交替过程中，应当先悬浮培养再贴壁培养。先悬浮培养可以有效地将神经干细胞与其它非神经干细胞区分开。

在一些实施方式中，当神经干细胞在悬浮培养中传代一次时，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。优选，当神经干细胞在悬浮培养中传代一次且状态良好时，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。所述状态良好是指神经球大小均匀、神经干细胞在显微镜视野下发亮、且细胞活率不低于95%。因为，此时的神经干细胞的生长状态处于最佳时期，适于转变为贴壁培养方式。在一些实施方式中，当贴壁培养的神经干细胞达到70%-80%融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换。

在具体实施方式中，当神经干细胞在悬浮培养中培养24h时完成了一次传代且状态良好，即可进行悬浮培养至贴壁培养的转换。应当理解，不同培养批次可以稍有不同，在20-30小时之间，大多在24小时左右，但不限于此。当贴壁培养的神经干细胞达到80%融合时，即可进行贴壁培养至悬浮培养的转换。

可以理解，这种悬浮-贴壁的交替培养可以重复多次。理论上讲，只要条件稳定，这种交替培养可以重复数次、甚至数十次。因为，这主要取决于神经干细胞自身的生物学性质，曾报道神经干细胞经传代50次后仍具有干细胞特性。鉴于此，本领域技术人员可以根据神经干细胞的来源、神经干细胞的初始状态、临床需求、实验室条件等自行确定重复的次数。在实践中，为了避免操作周期过长，重复6至7次是较客观、经济的选择。在一个具体实施方式中，重复了1至2次。

在一些实施方式中，神经干细胞是哺乳动物神经干细胞。哺乳动物包括但不限于猴、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、人。在一些具体实施方式中，神经干细胞是人神经干细胞。

在一些实施方式中，根据本领域常规方法提供神经干细胞。在一些具体实施方式中，通过商业购买、细胞中心提供、医疗机构收集等途径来提供神经干细胞。在一些具体实施方式中，可以自行制备神经干细胞，例如从捐献者的组织中通过机械吹打、研磨、或酶消化的方法制备神经干细胞的单细胞悬液，来提供神经干细胞。

在一些实施方式中，根据本领域常规方法进行神经干细胞的悬浮培养。神经干细胞的悬浮培养是本领域公知的成熟技术，例如杨小锋，2005；Sigma技术手册N3660-1EA；Laura Pacey KK等人，2006和郑可，2005等中所描述的那些方法。任何适合的培养基以及培养条件均可用于进行神经干细胞的悬浮培养。在一些具体实施方式中，在无血清的DMEM/F12培养基中进行悬浮培养。在一些具体实施方式中，无血清的DMEM/F12培养基pH范围为7.0至7.2；优选7.0。在一些具体实施方式中，培养条件为在5%CO₂培养箱37℃中培养。