[发明专利]高产DL-丙氨酸的生产菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体地说，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌来源的D-丙氨酸消旋酶表达菌种。

背景技术

DL-丙氨酸，化学名为DL-α-氨基丙酸（简称丙氨酸），分子式为CH3CH(NH2)COOH，分子量89.09，无色至白色无臭针状结晶或结晶性粉末，有甜味，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和丙酮，无旋光性。DL-丙氨酸主要用做食品添加剂，同时也是重要的医药中间体。在国外已广泛应用于食品工业，年需求量很大，且增长迅速，其主要生产国为日本，主要生产企业有武藏野化学株式会社和味之素。

现有的DL-丙氨酸生产工艺主要有化学合成法、生物发酵法和丙氨酸消旋酶法三种。化学合成法主要包括：Strecker法、Buchere法、α-卤代羧酸氨化法、相转移催化合成法和L-丙氨酸化学消旋法等。Strecker和Buchere法原料价格便宜，但中间产物水解后分离比较困难，氰化物的运输和管理比较困难；相转移催化合成法原料便宜易得，但操作周期长，原料用量大，生产过程安全性不高，反应需要低温冷冻，提取使用离子交换树脂处理效率低，废水排放较大。

α-卤代羧酸氨化法原料易得，对设备要求不高，但该法生成大量副产物氯化铵，分离要采用大量甲醇醇析而导致精制成本较高，有机溶剂挥发严重污染环境，易燃易爆，生产安全性不高，催化剂用量大，生产成本相对较高。

L-丙氨酸化学消旋法原料价格较高，反应过程对设备的腐蚀较大。但该工艺提取过程简单，收率83%。

随着90年代假单胞菌L-天冬氨酸-β-脱羧酶生产L-丙氨酸技术的运用推广，L-丙氨酸的价格持续下降，这使得化学消旋法生产DL-丙氨酸成为可能。

生物发酵法虽然具有生产条件温和，对环境友好的优点，但根据目前已报道的发酵水平来看，糖酸转化率较低，发酵液的组成比较复杂，提取成本较高。该法的生产成本远高于化学合成法。

丙氨酸消旋酶法生产工艺是以L-丙氨酸为原料、消旋酶为催化剂的一步生化反应。其设备简单，反应条件温和，酶活力高，反应速度快，提取工艺简单。该法收率很高，一般为95%左右。在目前L-丙氨酸的价格下，丙氨酸消旋酶法生产工艺具有很明显的成本优势，是一条绿色经济的生产路线，其必然成为DL-丙氨酸生产工艺的发展方向。然而，目前本领域尚缺乏能够高效地生产丙氨酸消旋酶的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效表达D-丙氨酸消旋酶的基因工程菌。

本发明的第一方面，提供了一种产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株，所述菌株为大肠杆菌并且携带表达枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达载体。

在另一优选例中，所述菌株的保藏号为CCTCC M2013188。

本发明的第二方面，提供了一种如本发明第一方面所述的表达菌株的制备方法，所述的方法包括步骤：

(a)提供一表达载体，所述表达载体携带枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的表达盒；

(b)将所述表达载体转入大肠杆菌，从而获得本发明第一方面所述的产生D-丙氨酸消旋酶的工程菌株。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤:

(c)对步骤(b)所述菌株进行紫外诱变，得到D-丙氨酸消旋酶产量进一步提高的工程菌株。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述枯草杆菌D-丙氨酸消旋酶的编码序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的步骤(a)中所述的表达载体是用以下方法制备的：

(i)用如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的引物，以枯草杆菌基因组DNA为模板，进行核酸扩增，得到扩增产物；

(ii)用Ndel和BamHI对扩增产物进行酶切，得到酶切产物；和

(iii)将所述酶切产物与用Ndel和BamHI进行酶切的载体质粒用DNA连接酶进行连接，从而形成所述的表达载体。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述的酶切时间为1-12小时，较佳地为2-10小时。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，所述Ndel与酶切体系的体积比为0.5～5:50，较佳地为1～3:50。

在另一优选例中，在步骤(c)中，紫外诱变的时间为1～10min，较佳地为3～5min。