[发明专利]一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞的分离与鉴定方法，特别涉及一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法。

背景技术

最近的研究表明，小鼠骨髓中存在着除了造血干细胞以外的其他干细胞，像间充质干细胞；内皮祖细胞；多能成体细胞等干细胞。最近，利用多参数筛选技术，在小鼠的骨髓中鉴定出一群比较稀有的细胞，数量大约在0.02%左右Sca-1阳性，Lin阴性，CD45阴性的细胞，利用PCR技术发现这些细胞表达多能干细胞的标志如SSEA-1，Oct-4，Nanog和Rex-1。这些细胞在年轻小鼠（四周龄左右）的骨髓中含量最高，并随着年龄的增长而降低。与寿命长的B6小鼠想比，寿命短的DBA/2小鼠中的这种细胞数量明显减少。这些细胞可以表达CXCR4，c-met和LIF-R，能和SDF-1HGF/SF和LIF发生强烈的反应。因为它们可以粘附于成纤维细胞，所以可以同骨髓中的贴壁细胞一块被分离。这群Sca-1阳性，Lin阴性，CD45阴性的极小胚胎样干细胞在发育的早期就存在于骨髓中，它可能是组织/器官再生的多能干细胞。

VSEL-SCs最先通过趋化分离和免疫荧光激活细胞分选相结合的方法得到。首先从4周龄大的健康小鼠股骨骨髓中分离得到单个核细胞，用低渗的方法除去混杂的红细胞后添加SDF-1进行趋化作用，表达CXCR4受体的细胞能够与SDF-1反应结合而得到初步分离；然后再利用FACS对筛选出的CXCR4+细胞进行CD45标志的分选，得到CXCR4+/CD45+和CXCR4+/CD45-两细胞群。通过直接显微镜观察CXCR4+CD45-细胞群含有稀少的直径约2～4μm小细胞，这些细胞相对表达较多的Oct-4，Nanog等多能干细胞标志。后来Kucia等认为，表达多能干细胞标志的小体积CXCR4+CD45-细胞也可以通过用FACS分选。

选Sca-1+细胞而得到，Sca-l可以代替CXCR4成为FACS分选的标志。因此VSEL-SCs可以通过FACS方法，利用高速流式细胞分选仪从小鼠骨髓单核细胞悬浮液中直接分选标志为Sca-1+/Lin-/CD45-，直径在2～10μm的细胞。

Kucia等在鼠的肾和睾丸等其他器官中，利用与分离鼠骨髓VSEL-SCs相同的方法对体积较小的Sca-1+/Lin-/CD45-细胞进行分选，得到了与小鼠的极小胚胎样干我相似的干细胞群。最近，Zuba-Surrna等通过图像流分析、共聚焦显微镜及实时RT-PCR研究显示小鼠的脑、肾、肌肉、胰腺和骨髓中的Oct-4+，极小胚胎样干细胞含量最多。一些表达胚胎干细胞、上胚层干细胞、原始生殖细胞表面标志的干细胞群也相继在表皮、气管上皮、心肌膜、胰、视网膜、羊水等非造血器官被发现。由于定位组织和所处微环境的不同，这些细胞的大小和表面标志也不尽相同，但在体外都可以向三个胚层细胞分化。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法，本发明是一种新的干细胞的标记分离方法，能够实现与胚胎干细胞进行了区别鉴定。

极小胚胎样干细胞是指Sca-1阳性，Lin阴性，CD45阴性干细胞，在发育的早期就存在于骨髓中，它可能是组织/器官再生的多能干细胞。CXCR4+CD45-细胞群含有稀少的直径约2～4μm小细胞，Sca-1+/Lin-/CD45-，直径在2～10μm的细胞。

本发明一方面利用流式细胞术通过使用抗体标记而获得极小胚胎样干细胞。

另一方面利用全基因组的表达谱分析了极小胚胎样干细胞与胚胎干细胞以及其他成体干细胞的比较，发现了其与胚胎干细胞及其他成体干细胞的基因表达谱的差异。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骨髓单个核细胞的分离

(1.1)四周龄的C57/BL6小鼠骨髓细胞；

(1.2)用70um的滤器将细胞过滤，4℃500g，离心15分钟；

(1.3)去掉上清，加入5ml红细胞裂解液,置于于冰上裂解5分钟，期间偶尔摇动一下，加入20ml的PBS终止反应；

(1.4)4℃500g,离心15分钟，加入缓冲液，缓冲液为2%FBS的PBS，含有2mM的EDTA。

（2）单个核细胞标记与极小胚胎样干细胞分选

(2.1)骨髓单个核细胞重悬于缓冲液中，加入FCS，浓度为20%，置于冰上作用20分钟,4℃500g离心10分钟；