[发明专利]一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法

权利要求书

1.一种小鼠骨髓极小胚胎样干细胞的分离与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）骨髓单个核细胞的分离；

（2）单个核细胞标记与极小胚胎样干细胞分选；

（3）极小胚胎样干细胞RNA的提取；

（4）转录PCR检测多能基因的表达；

（4.1）反转录，

（4.2）PCR反应，

（4.3）琼脂糖凝胶电泳；

（5）极小胚胎样干细胞与胚胎干细胞表达谱的比较；

（5.1）RNA的提取，

（5.2）RNA的浓度测定，

（5.3）Illumina法比较。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）、骨髓单个核细胞的分离还包括：

(1.1)四周龄的C57/BL6小鼠骨髓细胞；

(1.2)用70um的滤器将细胞过滤，4℃500g，离心15分钟；

(1.3)去掉上清，加入5ml红细胞裂解液,置于于冰上裂解5分钟，期间偶尔摇动一下，加入20ml的PBS终止反应；

(1.4)4℃500g,离心15分钟，加入的缓冲液，缓冲液为2%FBS的PBS，含有2mM的EDTA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）、单个核细胞标记与极小胚胎样干细胞分选还包括：

(2.1)骨髓单个核细胞重悬于缓冲液中，加入FCS，浓度为20%，置于冰上作用20分钟,4℃500g离心10分钟；

(2.2)弃上清，加入缓冲液，充分混匀，取5只FALCON管，其中1只为同型对照染色管，3只为单染管；

最后1只为分选细胞管，加入3种荧光标记的抗体：PE标记的Lineage抗体混合物；PE-Cy5标记的CD45单克隆抗体；FITC标记的Sca-1单克隆抗体；同型对照染色管加入3种相对应的同型对照抗体；

3只单染管分别加入其中一种荧光标记抗体和其余2种同型对照抗体，涡旋振荡器充分混匀，置于冰上，避光孵育15分钟；

(2.3)用含有2mM EDTA的2%FCS/PBS洗涤，离心，去上清，重悬于2%FCS/PBS中，上Moflo XDP cell sorter分选，设定Lin^-Sca-1⁺CD45^-细胞群为极小胚胎样干细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）极小胚胎样干细胞RNA的提取还包括：

(3.1）分选的极小胚胎样干细胞置于EP管中，加入1ml TRIzol充分混匀，15-30℃放置5分钟，

(3.2）按照0.2ml氯仿/1ml TRIzol Reagent的比例，在步骤3.1的混合物中加入200μl氯仿,盖好管盖，用涡旋振荡器剧烈振荡15s,15-30℃放置2-3min后，4℃,12000g，离心15min，

(3.3）取最上层含有RNA的水相层,大约为总体积的60%左右，转移到新EP管中，加入等量的异丙醇混合，室温，10min，12000g,15分钟；弃去上清，加入75%的无水乙醇，用涡旋振荡器混合样品15s，4℃条件下7,500×g离心5min；

(3.4)室温晾干RNA，放置在空气中晾干5-10min，不要让RNA完全干燥，加入35μl或者40μl的无RNase水中，混匀，-70℃冰箱冻存备用。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4.2)PCR的引物如SEQ ID No.1～12所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4.3)琼脂糖凝胶电泳还包括：

(4.3.1)准确称量琼脂糖干粉0.5g，加入50ml电泳缓冲液TAE，微波炉沸腾至清澈透明，熔化的琼脂冷却至60℃时，加入10mg/ml溴化乙锭充分混匀，EB的终浓度是1μg/ml，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳；

(4.3.2)胶凝固之后，轻轻移去梳子，加DNA样品及进行电泳：取5μl DNA加1μl加样缓冲液混合，加样缓冲液为6*Loading buffer，使吸管与加样孔垂直，使吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNA样品加入加样孔中；

(4.3.3)加样完毕后，正确连接电泳槽和电源，电压90mV，电泳30min。