[发明专利]一种大肠杆菌表达菌株及用其生产N-乙酰-D-神经氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体是涉及一种基于基因组的酶催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法。 

背景技术

季节性流感和高致病性禽流感是威胁人类健康的大敌。疫苗和引物是治疗流感的两种方式，由于流感病毒不断变化，针对流感病毒的疫苗常常难以有特定的疗效，而且高致病性禽流感常常是突发的，而开发疫苗至少需要数月的时间，因此抗流感药物是必不可少的治疗手段。 

抗流感药物的种类较为缺乏，仅有神经氨酸酶抑制剂奥斯米韦、扎那米韦和帕拉米韦。奥斯米韦的临床效果最为明显，使用的也最广泛。但奥斯米韦也有着一些不足。如奥斯米韦有导致患者精神异常、产生幻觉等多种副作用，甚至造成患者死亡，而扎那米韦没有这些毒副作用。H1N1型和H5N1型病毒株的H274Y突变株（即274位组氨酸突变为酪氨酸）表现为奥斯米韦耐药和对扎那米韦敏感，最近发现的帕拉米韦耐药株对奥斯米韦和对扎那米韦均敏感。这些均表明扎那米韦是不可替代的抗流感药物，目前国际市场上扎那米韦的需求量巨大，价格昂贵。 

N-乙酰-D-神经氨酸是合成扎那米韦及其它神经氨酸酶抑制类抗流感药物的关键原料。N-乙酰-D-神经氨酸最初是从聚唾液酸（唾液酸以α-2,8或α-2,9酮苷键连接的线性同聚物）水解，或从鸟巢，奶类和卵黄等提取而获得，这些传统方法的缺陷是产量低，步骤烦琐，工艺不稳定，所得产物的纯度较低，故难以进行大规模生产。目前工业化生产N-乙酰-D-神经氨酸均采用酶催化的方法。酶催化反应途径为首先以价格低廉的N-乙酰-D-葡萄糖胺为原料，通过在大肠杆菌中表达的N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶生成N-乙酰-D-甘露糖胺，后者在大肠杆菌中表达的醛缩酶作用下和丙酮酸缩合而催化合成N-乙酰-D-神经氨酸。 

目前采用的酶来源是将异构酶基因和醛缩酶基因克隆在载体上，在大肠杆菌中过量表达，此后分离纯化得到纯酶或采用全细胞进行催化。这种克隆在载体上进行表达的方式较为有效，但存在着一些固有的缺点，如两个基因需要分别克隆在各自的载体上，转化得到两个菌株，再分离诱导酶的表达；需使用抗生素以维持质粒的荀子，但抗生素的使用增加了酶的分离纯化的难度和产品的价格、克隆于质粒上的基因存在菌株不均一以及基因的活性在长时间使用后会降低等等问题。这些都有可能对基因的表达和酶的活性不利。此外，对宿主菌的基因组进行操作以提高转化效率的实验过程也不简便。 

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种大肠杆菌表达菌株，以及应用该菌株基于生产N-乙酰-D-神经氨酸的方法。 

本发明所述大肠杆菌表达菌株，是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)CGMCC No.7483。 

大肠埃希氏菌CGMCC No.7483是由如下方法获得：将分别置于T7强启动子之下的来源于多形拟杆菌VPI-5482基因组中的异构酶基因BT0453和来源于大肠杆菌的醛缩酶基因nanA整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的malE基因区域而获得重组的基因工程菌。 

整合至大肠杆菌BL21(DE3)基因组采用的是来源于λ噬菌体的重组酶所介导的同源重组方法。来源于λ噬菌体的重组酶是由Redα，Redβ和Redγ这三个酶所组成，Redα编码5'→3'DNA外切酶，Redα酶切转化的DNA底物获得单链DNA、Redβ编码单链结合蛋白，结合在Redα所生成的单链DNA上，并促进同源重组的发生、Redγ编码Gam蛋白，防止菌体内部的外切酶对外来DNA的降解。重组酶基因置于由LacI基因所严谨调节的pLac启动子之下，pLac在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导之下进行表达。重组酶所介导的同源重组方法称为重组工程，重组工程简便、高效、适用范围广。 

本发明还公开了一种用大肠埃希氏菌CGMCC No.7483催化合成N-乙酰-D-神经氨酸的方法，是将该菌株在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导之下表达异构酶BT0453和醛缩酶NanA，以全细胞为催化剂，N-乙酰-D-葡萄糖胺和丙酮酸钠底物，催化合成N-乙酰-D-神经氨酸。实验证明产量可达36.3%。 

采用大肠埃希氏菌CGMCC No.7483菌株进行催化合成N-乙酰-D-神经氨酸体系的优点在于：两个基因均位于基因组上，避免了基于质粒系统的一系列问题，操作简便快捷，产量高，后续的基因操作更加容易，无需每次转化克隆有基因的质粒，