[发明专利]一种褪黑素的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种褪黑素的测定方法，尤其涉及一种褪黑素的快速测定方法。

背景技术

褪黑激素即褪黑素（英文名称为Melatonin）是一种参与抗氧化系统，防止细胞产生氧化损伤的药物。其化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，，为脂溶性物质，分子式为C₁₃H₁₆N₂O₂。褪黑素的最高紫外吸收峰在206、233、278nm，对光、热均稳定，具有安眠作用，但服用量有一定的控制，随意长期使用，可能干扰或导致整个内分泌系统紊乱而引发其他疾病。

褪黑素片使用说明书中描述：正常人在上午11:45口服0.1～10mg褪黑激素后，其血清浓度达到正常人夜晚平均浓度水平；0.1、0.3、1.0和10.0等各剂量组均使受试者口腔温度下降、入睡时间明显缩短、睡眠持续时间明显延长、精力下降、疲劳感增加、情绪低下、对Wilkinson听觉觉醒试验反应正确率下降。服药1h后血清药物浓度达到峰值(平均为25817pg/mL)，显著高于正常人血清浓度，睡前醒觉时间、入睡时间缩短，睡眠质量改善，睡眠中觉醒次数明显减少，而且睡眠结构调整，浅睡阶段缩短，深睡阶段延长，次日早晨唤醒阈值下降。口服0.3mg和1.0mg褪黑激素，能使入睡和进入睡眠第二阶段时间缩短，但未影响REM(Rapid eye movements，快速眼动)期，表明褪黑激素有助于改善失眠症。

现有的检验药品、保健品中褪黑素含量的方法主要有以下几种：

1.高效液相色谱法

样品研碎加入溶剂，超声提取后离心过滤，利用褪黑素在紫外222nm处有最大吸收峰的特点，测定其含量。

高效液相色谱法是常用的现代分析方法。在相同的色谱条件下，不同的物质有不同的色谱保留时间。在相同是色谱条件下褪黑素溶液对照样品溶液和样品提取所得的供试品溶液分别进样，根据色谱保留时间定性，根据峰高或峰面积定量可检测褪黑素的含量。

高效液相色谱法的优点是色谱分离效率高，灵敏度高。其缺点是：（1）仪器价格昂贵，样品前处理时间长，大多数针对单一产品，使用的流动相多为一定比例的甲醇和盐溶液，试验后需要用大量水冲洗色谱柱，色谱柱易受污染，分析成本高；（2）当共存成分的色谱保留时间与褪黑素的色谱保留时间接近时容易作出错误的判断；（3）仪器对使用环境要求高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

2.高效液相色谱-质谱联用法

用质谱仪对物质进行定性分析，结果可靠性高。以高效液相色谱仪作为分离器、质谱仪作为分析器的高效液相色谱-质谱联用法适合于成分复杂、背景干扰严重的样品分析，这种分析方法可提高检测结果的可靠性，检测结果较准确。

高效液相色谱-质谱联用法是一种分析成本比高效液相色谱法更高、操作比高效液相色谱法更复杂的分析方法。仪器对使用环境要求更高，需要固定摆放，不适合作流动性大的现场检测。

在进行高效液相色谱-质谱联用法分析前，一般用高效液相色谱法作为筛选方法，以达到降低分析成本的目的。这些检验只能在少数实验室中进行，不易推广使用。

3.酶联免疫法

使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

酶联免疫法的缺点是酶联免疫试剂盒成本较贵，国产质量还不过关，单个样品检测时间长。

发明内容

为克服现有方法存在的不足，本发明的目的在于提供一种黑色素的快速测定方法，本发明所提供的测定方法分析成本低，不需要使用贵重分析仪器、专属性强、灵敏度高，适用于现场检验药品、保健品中褪黑素含量是否超标。

本发明所提供的褪黑素的测定方法，包括如下步骤：

(1)用溶剂萃取待测样品，提取褪黑素；

(2)将步骤(1)的萃取液过滤或离心分离后，蒸发；

(3)在步骤(2)蒸发后的萃取液中加入检测剂和缓冲溶液，加热，观察颜色。