[发明专利]哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶的方法及其分离纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及产酶的方法及其分离纯化方法。

背景技术

生物脱氮是目前国内外公认的最为有效、最具应用前景的去除水中氨氮污染的技术，也是当前水污染控制领域的研究重点与热点。然而硝化过程在温度低于15℃时会严重受到抑制，硝化速度减慢甚至停止。水中的硝化过程是由一系列氧化还原酶组成的电子传递链完成，其中氨单加氧酶(Ammonia monooxygenase，AMO)将氨氮氧化形成羟胺(NH₂OH)，在氨氮降解过程中起限速作用。提高微生物体内氨单加氧酶的量及活性，可利用提高氨氮降解速度。

最初的氨单加氧酶基因是从Nitrosomonas europaea中扩增出来的，但是由于氨单加氧酶在体外极不稳定，所以很长时间内未能分离纯化而出。Moir等人克服了上述缺点，于1996年从异养硝化菌Paracoccus denikjicans分离出来了由两个亚基组成的氨单加氧酶，一个亚基分子量为38kDa，另一个亚基分子量为46kDa(Mior J.W.B.，Crossman L.C.，Spiro S.，Richardson D.J.The purification of ammonia monooxygenase from Paracoccus denitrificans.FEBS Letters，1996，387：71-74)。为了防止氨单加氧酶失去活性，所以分离提纯过程中温度一直保持在4℃，说明在低温下，氨单加氧酶活性更高。而Paracoccus denitrificans的最适培养温度为37℃，在此高温条件下，产酶速度势必受到影响。而目前关于如何提高氨单加氧酶的产酶方面还没有明确的研究报道。

发明内容

本发明目的是为了解决高温下氨单加氧酶产酶量低的问题，而提供哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶的方法及其分离纯化方法。

哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶的方法，按以下步骤进行：

将哈工大异养硝化不动细菌L7(Acinetobacter Heteronitrifihit L7)菌株接种到产酶液体培养基中，接种量为10％，在160rpm/min、4℃培养70～78h，即完成哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶；其中产酶液体培养基的组分如下：NH₄Cl0.5g/L、CH₃CH₂ONa1.0g/L、MgSO₄·7H₂O0.5g/L、K₂HPO₄0.2g/L、NaCl0.12g/L、0.1g/L CuCl₂、血清蛋白0.2g/L、Cty C0.01g/L、维生素C0.01g/L和余量的蒸馏水，pH值7.8～8.2。

哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶的分离纯化方法，按以下步骤进行：

一、将哈工大异养硝化不动细菌L7(Acinetobacter Heteronitrifihit L7)菌株接种到产酶液体培养基中，接种量为10％，在160rpm/min、4℃培养70～78h，然后在6000rpm离心5min后收集菌体；

二、将菌体用10mmol/L、pH8.5的Tris-HCI缓冲液重悬后置于冰水浴中超声破碎15min，然后将破碎液采用溶菌酶对细胞进行破碎，通过渗透作用，制备不含溶菌酶的细胞膜；

三、应用DEAE-CL6B离子交换柱对收集的细胞膜进行分离，并用50mM、pH7.5的Tris-HCl进行平衡，同时加入0.02％的十二烷基-β-D麦芽糖苷，在相同的缓冲液中，用0-2mM梯度NaCl进行洗脱，氨单加氧酶在30mM的NaCl条件下从离子交换柱中洗脱下来，然后采用耗氧速率法测定氨单加氧酶活性，收集有活性的溶液，并用交联聚丙烯酰胺葡聚糖S-100的凝胶过滤层析进行进一步分离，洗脱溶液为0.05M磷酸+0.15MNaCl+0.02％十二烷基-β-D麦芽糖苷，pH7.5，收集的样品，即完成哈工大异养硝化不动细菌L7产低温氨单加氧酶的分离纯化；