[发明专利]一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，更具体涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌，同时还涉及一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌的构建方法和该基因工程菌的用途。不仅适合多种核糖体失活蛋白工程菌的构建，也有利于具活性的核糖体失活蛋白的简易化、规模化生产。该方法也为Alpha-苦瓜素蛋白及其他核糖体失活蛋白在体外的抑菌应用奠定了理论基础。

背景技术

植物在生长过程中会受到环境中各种细菌、真菌、病毒等各种病原菌的侵染。真菌和细菌病害是植物病害中最为严重的一类，占据总数的80%以上，几乎所有的高等生物都受到病原菌的危害。病原菌侵入到植物体内能够引起植物病害，往往导致农作物遭受重大的损失，甚至颗粒无收，因此病原菌对农业生产有着重要的影响。传统的化学药剂的应用常常导致农作物上有药物残留，同时也加剧了病原菌的变异速率和耐药性，因此在植物体中特别是食用植物中寻找广谱、高效、低毒、不耐药的的病原菌抑制剂已经成为国内外研究的热门领域之一。其中，克隆具有广谱抗菌活性的蛋白质基因，并利用基因工程的手段将其导入到植物中培育抗病品种，或者转入大肠杆菌或酵母细胞内生产抗微生物药物，已成为近几年的研究热点。此外，一些多肽抗生素在植物抗病原菌实验中取得了较好的效果。

在长期的进化过程中，植物自身抵抗病原菌的防御体系会合成一些相应的生物分子以拮抗外源侵袭物，而其中能够抑制病原菌生长或杀死病原菌的抗菌蛋白就是最为重要的一类。目前，已经从70多种植物中发现了170多种抗菌蛋白。随着对抗菌蛋白作用机制研究的深入，多个抗菌蛋白基因被鉴定出来，根据植物抗菌蛋白的作用机制、结构和序列特性，可将其大体分为以下几类：病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)、防御素(defensins)、类亲环素蛋白(cyclophilin-like proteins)、核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating proteins,RI Ps)、脂质转运蛋白(lipid-transfer proteins,LTPs)、蛋白酶抑制剂(protease inhibitors)、2S清蛋白类(2S albumin proteins)及其他蛋白。

其中，核糖体失活蛋白的研究历史比较久远，距今已经有一百多年的历史。核糖体失活蛋白起初分别是从蓖麻中提取了蓖麻毒蛋白(ricin)和从相思子(Abrus precatorius)中提取的相思子毒蛋白(abrin)。除了几个真菌和细菌来源的RIPs外，几乎所有的RIPs都来自于高等植物。迄今已经发现了百余种RIPs，其抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗肿瘤等活性引起了人们的广泛关注。RIPs分为三类：I型RIPs，由相对分子质量为30kDa左右的单肽链组成；II型RIPs，由具有酶活性的RTA链和凝集素活性的RTB链构成；III型RIPs目前只在玉米(Zea mays)和大麦(Hordeum vulgare)中发现，分别为b-32、JIP60，它们在移除了内部的一个短肽片段后，才具有酶活性。起初RIPs的酶活研究主要集中在RNA N-糖苷酶活性上，Endo等人（1988）首先检测到ricin作用在大鼠28S rRNA的α-sarcin/ricin区域(SRL)的GA⁴³²⁴GA序列，通过脱去A⁴³²⁴从而阻止延长因子EF-2与核糖体的结合，进而抑制蛋白质的生物合成。这个结论得到Stirpe等人的推广，认为所有具有RNA N-糖苷酶活性的RIPs都有类似的作用。此外，RIPs还被检测到具有脂肪酶活性、几丁质酶活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、磷酸酶活性、DNA糖基化酶活性，以及超螺旋DNA的解旋酶等活性。在20世纪20年代，人们将美洲商陆(Phytolacca heterotepala)叶子的粗提物擦拭在植物的表面作为抑制病毒的试剂进行检测。实验成功后，大量的生物技术试验证明了RIPs是植物防御病原菌的重要工具。目前，所有已发现的I型RIPs对植物、真菌、动物病毒均显示出广谱的抗菌活性，部分II型RIPs亦表现出此性质。RIPs的转基因植物（烟草、小麦、水稻、玉米等）均表现出较强的抗病毒活性。此外，部分RIPs在抗肿瘤细胞、HIV感染细胞、骨髓瘤细胞、破骨细胞分化、骨免疫学方面均显示出广范的应用前景。