[发明专利]一种高效表达Alpha-苦瓜素蛋白的基因工程菌及构建方法和应用

权利要求书

1.一种基因工程菌，其特征在于：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) / pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174。

2.权利要求1所述的一种基因工程菌表达的蛋白，其序列为SEQ ID NO.1所示。

3.权利要求2所述的一种蛋白的制备方法，其步骤是：

1）液体培养细菌体积至1 L，当OD600为0.6时加入0.75 mM IPTG，在28°C培养条件下培养10 h诱导Alpha-苦瓜素蛋白的表达，12,000g离心10 min收集菌体，并用50 mL预冷的PBS重悬；

所述的细菌为：大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) / pET-28a-αMC，CCTCC NO.M2013174；培养基为含50 μg/mL Kanamycin的LB液体培养基；

2）在-78°C 30 min和37°C 30 min两个温度条件下反复冻融菌体细胞5次，按照10 mL/次，45 W，15 min，间隔10 s的条件对菌体进行超声破碎，12,000g再次离心10 min，收集包含115 mg/L的Alpha-苦瓜素蛋白的菌体上清液；

3）经Ni-NTA亲和层析纯化蛋白：按照每40 mg重组Alpha-苦瓜素蛋白使用1 mL的Ni-NTA树脂的比例取适量的树脂进行装柱；用含20 mM PBS，0.5 M NaCl，pH 7.8的结合缓冲液平衡Ni-NTA柱子后将菌体上清液反复过柱3次；先用6倍柱体积的结合缓冲液和4倍柱体积的含20 mM PBS，0.5 M NaCl，pH 6.0的洗脱缓冲液分别洗脱未结合的杂蛋白；再用5倍体积浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液逐次洗脱结合程度较低的杂蛋白；最后用5倍体积含175 mM、200 mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱与Ni-NTA树脂结合的Alpha-苦瓜素蛋白；

所述的浓度逐渐增加的咪唑洗脱缓冲液其浓度分别为：10 mM；25 mM；50 mM；75 mM；100 mM；和150 mM；

4）将洗脱下来的目的蛋白装入到直径 22 mm，分子截留量14 kDa的透析袋内，在4°C条件下用去离子水透析除去盐离子和小分子咪唑，每4 h换一次水，透析24 h；

5）透析过的蛋白质溶液用PEG20000进行浓缩至水分减少至原体积的10%，收集透析袋内的高浓度蛋白质溶液，分装至灭菌的1.5 mL EP管内冷冻干燥法除去剩余的水分，得到Alpha-苦瓜素蛋白干粉，于-78°C保存备用。

4.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制茄病镰刀菌生长中的应用。

5.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制尖孢镰刀菌生长中的应用。

6.权利要求2所述的一种蛋白在体外抑制铜绿假单胞菌生长中的应用。