[发明专利]用于分析(R)-特异性ω-转氨酶的方法

说明书

本发明是2010年8月13日提交的，发明名称为“用于鉴别和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法”，申请号为201080039297.2的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及用于筛选、表征和制备(R)-特异性ω-转氨酶的方法，由此获得的ω-转氨酶及其在各种氨基转移过程中的应用。

背景技术

手性胺在制药、农用化学和化学工业中发挥着重要作用。它们常被用作中间体或合成子(synthones)以制备各种生理学，如药学活性物质，如头孢菌素或吡咯烷衍生物。在手性胺的众多应用中，仅有一种特定的光学活性形式((R)或(S)对映体)具有生理学活性。因此，需要提供一种制备光学活性形式的手性胺的方法。

这些需求通过以下方法得到部分满足，即通过加入手性羧酸使非对映体盐结晶来制备手性胺(Breuer et al.,Angewandte Chemie(2004)116,806-843)。其它化学方法使用通过还原含C=N双键的前手性前体的对映选择性合成。

在已用于合成光学活性氨基酸和胺的若干酶促方法中，由于其用于光学活性胺的不对称合成的潜力，ω-转氨酶(ω-TAs)最近已得到更多关注，其常被用作多种药物制备的结构单元(building blocks)。

ω-转氨酶是PLP(磷酸吡哆醛)依赖性酶，其催化氨基转移反应。当采用ω-转氨酶时，主要可经由两种反应策略来制备所谓的对映体富集和/或纯光学活性胺：(i)从酮起始的不对称合成，和(ii)从外消旋胺起始的动力学拆分。虽然ω-转氨酶总体上显示出良好的对映选择性，但它们尚未被频繁地用在不对称合成中，尽管在不对称合成中理论上可能的产率是100%。使用ω-转氨酶的不对称合成的一个特殊要求是平衡向产物侧移动，特别是当使用诸如丙氨酸等氨基酸作为氨基供体时，因为在此情况下平衡状态在底物(酮、丙氨酸)侧，而不在产物(胺、丙酮酸盐)侧；另一个要求是酶必须具有最佳的对映选择性，而ω-转氨酶并非一向如此。因此，ω-转氨酶主要用于外消旋胺的动力学拆分，其中不需要最佳的对映选择性。因此，虽然已经研究了外消旋胺的动力学拆分，但50%最大产率的限制很大程度上阻碍了其应用。另一方面，不对称合成需要将不利的平衡向合成光学纯胺的单个对映体的方向移动，这是能够在工业规模上使用转氨酶的有效方法的一个重要先决条件。WO2007/093372公开了这类方法。

EP0 987 332A1公开了通过微生物酶，特别是源自节杆菌(Arthrobacter sp.)的(R)-选择性ω-转氨酶来制备光学活性氨基化合物，即(R)-氨基化合物的方法。EP1 038 953A1公开了另一种(R)-选择性ω-转氨酶，但其源自金色分支杆菌(Mycobacterium aurum)。

Iwasaki等(Biotechnol.Let.2003(25),1843-1846)、Koszelewski等(Adv.Synth.Catal.2008(350),2761-2766)和Iwasaki等(Appl.Microbiol.Biotechnol.2006(69),499-505)公开了源自节杆菌的R-特异性转氨酶。通常通过选择得自于如土壤样品的微生物并在培养中将其富集来完成提供有用(S)-或(R)-选择性转氨酶的微生物的鉴别(Jun等,App.Microbiol.Biotechnol.2004(70),2529-2534和Shin等(Biosc.Biotechnol.Biochem.2001(65),1782-1788))。特别地，全部所述的R-选择性ω-转氨酶均通过富集培养获得。此种方法耗时，这是因为对于有效的方法，通常优选在诸如大肠杆菌(Escherichia coli)等异源生物体中过表达酶。这需要从野生型生物体中分离基因序列，但DNA序列的克隆不总能成功并且是极为耗时的过程。

特别地，在工艺开发和新型ω-TA的鉴别期间，酶的纯化及其酶促性质的表征很受人关注。然而，由于通常通过诸如HPLC或毛细管电泳(CE)等低通量方法确定ω-TA活性，所以在一定程度上，酶性质的确定通常是限速步骤。