[发明专利]三种姬松茸SSR分子标记、其制备方法及使用其鉴别姬松茸菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及三种姬松茸SSR分子标记、其制备方法及使用其鉴别姬松茸菌株的方法。

背景技术

姬松茸拉丁学名Agaricus blazei Murrill，是一种珍稀食药用菌，它在真菌分类学上属于担了菌门、伞菌目、蘑菇科、蘑菇属，原产于美国、巴西等地，人工栽培始于日本。1992年，福建省农林科学院食用菌中心引进了该菌种，并在国内首次栽培成功（江枝和1993），而后推广到全国各地。该菇不仅味道鲜美、营养丰富，而目具有降血压和抗癌的食疗功效(戴玉成和杨祝良2008；Dai et al. 2009 )。考虑到该菇的价值极高，自2001年起，我们利用Co⁶⁰辐射诱变筛选姬松茸突变株并获得一些具有一定程度性状改变的菌株(江枝和等2003；江枝和等2004；翁伯琦等2007)，并予推广。

    微卫星(microsatellite)序列，又称为简单序列重复(simple sequencerepeat，SSR)，是以少数几个核苷酸(一般2～4个)为重复单位的串联重复DNA序列。它均匀、随机、广泛地分布于真核生物基因组中，且同种生物中微卫星序列的两侧顺序常较保守，其特异性引物扩增具有良好的重复性和保真性。由于大多数微卫星序列存在非转录区，变异频率高，因而在品种间具广泛位点变异。因此，真核生物基因组中微卫星分了标记的开发与利用成为一个热点。目前对真菌微卫星的研究主要集中在动植物病原菌，食用菌SSR分子标记的开发和应用还非常少(张瑞颖等2010)，多用在香菇、草菇、灵芝属上，如200710040319、201110146770、200810204544、200810204545、200810204550等，在姬松茸目前还没有开发使用的SSR分子标记，无法利用SSR分子标记进行快速的菌株鉴别。

目前已报道的主要开发食用菌SSR引物的途径有3条:一是基于DNA序列数据设计开发SSR引物。这对于己经拥有丰富EST或基因组DNA序列数据的食用菌是非常快捷的途径。二是基于ISSR抑制PCR的方法开发微卫星标记。其有过成功的报道，但也有报道称利用该方法开发金针菇和黑木耳的SSR位点，结果非常不理想。可能是由于真菌基因组中SSR的分布密度相对较低，所以ISSR扩增产物并非完全是SSR之间的序列，这导致该方法获得的序列中假阳性比较高(张瑞颖等2010)。三是近年来开发出的利用生物素标记SSR探针，与基因组DNA片段杂交后，用抗生物素蛋白吸附杂交片段以富集含SSR序列的基因组片段的方法。

发明内容

本发明的目的是提供三种姬松茸SSR分子标记其制备方法及使用其鉴别姬松茸菌株的方法，其克服了现有技术中暂无开发使用的姬松茸SSR分子标记，无法利用SSR分子标记对其进行快速的菌株鉴别的问题，具有多态性稳定、检测快速、使用方便的特点。

三种姬松茸SSR分子标记引物的序列如下①引物E 5’-GTCAATGGAAGGGGT-3’和5’-CATCACCACACACACA-3’； ②引物G 5’-CCGCTTGGGTTTCATCT-3’和5’-CA AACGCCTCAACCTCA-3’；③引物K 5’-CACCGGCGACCTGTA-3’和5’-CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’。上述无开发出的姬松茸SSR分子标记填补了目前的姬松茸SSR分子标记的空白，使得利用SSR分子标记对姬松茸进行快速菌株鉴别成为可能。

    上述三种姬松茸SSR分子标记的制备方法包括以下步骤：

   ⑴、CTAB 法提取姬松茸基因组DNA：①、称取0.1g姬松茸Co⁶⁰辐射诱变菌株J2～J66的菌丝或子实体，用去离子水冲洗干净后，迅速转入1.5ml离心管中；②、加入液氮，迅速用电钻捣碎，后加入600mlCTAB 并于65℃水浴1h，并每20min反转摇匀一次；③、加入等体积调制的氯仿-异戊醇，使步骤（1）②获得的溶液与氯仿-异戊醇体积比24:1，颠倒混匀后，于12000rpm离心6min，取上清液于新管中；④、向上清液中加入其2倍体积的无水乙醇或其2/3体积的异丙醇，于-20℃放置20min，用以沉淀DNA；⑤、步骤（1）④的溶液于12000rpm离心6min，去上清液后，加入75％乙醇清洗DNA于12000rpm离心2min后，再次去上清液；⑥、将步骤（1）⑤制得的DNA风干后加入50μl的TE缓冲液以溶解DNA备用；由于CTAB法对于不同作物的提取方法略有不同，上述方法是对传统CTAB 方法改良后的基因组DNA提取方法，使用该方法提取的姬松茸基因组DNA得率更高。