[发明专利]全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，属于荧光显微成像领域。

背景技术

生命科学从宏观逐渐走向微观，在亚细胞水平实现生理条件下蛋白质、核酸等生物分子成像表征，对揭示生命的奥秘、提高疾病的预防、诊断、治疗水平具有重要意义。

荧光成像是最常用的成像表征技术，在细胞成像中，由于荧光标记往往不仅限于焦平面内，在使用普通宽场荧光显微镜成像时，焦平面以外的发光体往往会带来较强的背景荧光干扰，限制了它在亚细胞荧光追踪研究中的应用。2000年以来，研究人员开始在活细胞荧光成像领域使用全内反射荧光显微镜（Y.Sako,S.Minoghchi,T.Yanagida(2000)Nature Cell Biology2:168-172.），全内反射显微镜以其对细胞膜区域成像的优势在单分子荧光成像领域取得了巨大的进展。

全内反射荧光显微成像也是一种宽场成像技术，它是在传统宽场荧光显微镜的基础上，改变激发光的光路，通过调制激发光的入射角度，使激发光在折射率不同的两种介质的交界面发生全内反射现象。光线在界面处发生全内反射时，仍会向较低折射率的介质中投射一段很短的距离，一般在百纳米左右，被称为隐矢波或隐矢场。隐矢波的电磁场沿界面法线方向迅速衰减。这样一来焦平面以外的荧光分子不会被激发，背景荧光大大降低。在细胞成像中，这一深度刚好能照亮细胞膜区域，因此，全内反射荧光显微成像在细胞膜区成像非常有潜力。但是，全内反射荧光显微成像并不能直接应用到细胞内。由于细胞生命过程往往是连续的，在细胞膜上发生的生命活动往往也会延续到细胞内，例如细胞信号转导过程。如果能够将全内反射荧光显微镜拓展到细胞内，将是另一个突破。

半全内反射荧光显微成像就是一种介于普通宽场荧光显微镜和全内反射荧光显微镜之间的成像方法。当激光入射角稍小于临界角时，折射光会以接近平行的角度穿过细胞。折射光能够照亮一部分细胞内的区域，同时也会照亮细胞膜，也能获得背景干扰相对较低的荧光图像（B.X.Cui,et al.,Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America104:13666-13671(2007).）。由于细胞膜区的荧光也会干扰到细胞内区域的成像，信号背景比的提升不够明显，半全内反射荧光显微镜的应用受到了一定的限制。

此前，已有人应用宽场落射式荧光成像与全内反射荧光成像先后成像来对细胞内微管进行成像（J.Schmoranzer,S.M.Simon,Molecular Biology of the Cell14:1558-1569(2003).）。在全内反射荧光显微镜的光路上做一些调整，增加一条光路，就能够同时实现全内反射荧光显微成像和半全内反射荧光成像。既可以同时实现细胞内和细胞膜区交替成像，也可以通过细胞膜区漂白的方式来进一步提高细胞内荧光成像信号背景比。这一技术整合，将进一步拓展半全内反射荧光成像在细胞内成像中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，本发明通过在全内反射荧光显微照明系统中加入了第二路激发光，通过独立调节两路激发光的入射角度同时实现全内反射荧光成像和半全内反射荧光成像。

本发明所提供的全内反射照明与半全内反射照明双光路荧光显微系统，在激发光的光路上设置与光路呈135°的分光片Ⅰ，使激发光成为2束垂直的透射光和反射光；所述透射光经反射镜反射后与所述反射光平行；所述反射光和所述透射光的光路上分别依次设有渐变密度中性滤光片、

凸透镜Ⅰ、凸透镜Ⅱ和光斑孔径调节器；

所述反射光和所述透射光分别经过所述渐变密度中性滤光片、所述凸透镜Ⅰ、所述凸透镜Ⅱ和所述光斑孔径调节器后再分别通过反射镜调整传输方向成为2束垂直光路；

相互垂直的所述反射光和所述透射光的光路上均设有凸透镜Ⅲ；

所述反射光和所述透射光经过所述凸透镜Ⅲ后均入射至与所述反射光的光路呈135°的分光片Ⅱ，经所述分光片Ⅱ分成的2束平行光入射至显微镜激发光入口。

上述的双光路荧光显微系统，所述渐变密度中性滤光片与所述凸透镜Ⅰ之前设有光阀门。

上述的双光路荧光显微系统，所述光阀门可为机械阀门，具体可由电脑进行控制。

上述的双光路荧光显微系统，所述反射光和所述透射光均通过2个所述反射镜进行调整传输方向成为垂直光路。