[发明专利]一种发酵法制取埃博霉素B的方法

说明书

技术领域

本发明涉及埃博霉素B高产菌株的诱变选育及利用该菌株发酵制备埃博霉素B的方法，涉及微生物领域。

背景技术

埃博霉素B，英文名epothilone B，纤维堆囊菌Sorangium cellulosum 90的次级代谢产物，分子式为C₂₇H₄₁NO₆S，是一种大环内酯类的化合物。与之相似的次级代谢物还有epothilone A、epothione C、epothilone D、epothilone G、epothiloneH等。Epothilone B的相对分子量为506.25，熔点为93℃-94℃。

埃博霉素B有显著的选择性抗乳腺肿瘤细胞和结肠肿瘤细胞的活性，是一种微管超稳定的新型抗肿瘤活性物质。它可以通过稳定已经聚化的微管从而遏制细胞的有丝分裂。在20世纪90年代广泛应用于临床的是紫杉醇。但是临床试验表明，它对不同的实体瘤细胞有明显的抗肿瘤活性，且副作用多而受限制。如引发嗜中性白细胞减少症，外周神经病和脱毛症等；并且紫杉醇的低水溶性使得它必需由乳化方式给定，它本身可能影响心脏功能，导致过敏反应；此外，是P-糖蛋白的底物。P-糖蛋白可将许多细胞毒物质从细胞泵出，是肿瘤细胞产生多药物质抗性的原因。然而，紫杉醇的复杂的结构阻碍了通过化学修饰改善可溶性和降低毒性副作用的努力，所以引起了人们对相近作用模式但却具有好的特性化合物的研究。埃博霉素其离体抑制的效果比药物紫杉醇强2000-5000倍，作用的有效浓度为10～20ng/mL。在埃博霉素的类似物中，带甲基的埃博霉素B要比A基本上大2倍。比起紫杉醇来，埃博霉素B是一种更不易受P-糖蛋白作用的物质。因而埃博霉素B的抗肿瘤性能要比紫杉醇强的多，且其抗肿瘤谱要广的多。另外，紫杉醇可以从太平洋的紫杉的树皮中提取，但这种树生长极慢，所以来 源困难。但是对于埃博霉素B来说，可以通过纤维堆囊菌发酵，无限制的获得，可以解决抗癌药物的不足，且价格便宜。所以，此抗癌药物可能成为紫杉醇更新换代的新产品，所以开发比它更优越的埃博霉素来说是非常必要的。

然而，有关纤维堆囊菌的发酵条件及活性物质合成条件的研究报道很少，这一方面反映了纤维堆囊菌研究的困难；另一方面也是全球研究粘细菌生物活性物质合成的实验室太少的缘故。研究粘细菌，尤其是纤维堆囊菌的生长和次级代谢的条件对于开发粘细菌资源具有重要的意义。

纤维素堆囊菌的培养生产埃博霉素，为了进行埃博霉素的大规模生产，生物发酵是理想的途径。粘细菌纤维素堆囊菌的两种发酵产物埃博霉素A和B，已有专利报道了大规模发酵生产埃博霉素A和B。GerthK研究组利用纤维素堆囊菌Soce90进行350L(装液230L)发酵生产埃博霉素A和B，以XAD-16树脂作为吸附剂，分别得到埃博霉素A和B为11和22mg/L。但是在工业化生产中加入树脂带来管子堵住、设备磨损、灭菌不彻底很多不便，已有专利报道在发酵液中以环糊精代替树脂作为吸附剂来解决这一系列问题。又如李越中等以VY/2培养基作为纤维堆囊菌Soce90菌株的培养基，接种于ME培养液中，发酵培养4天左右，经分离提纯便得到埃博霉素B。

埃博霉素的发酵合成近年来研究的比较少，除外国的Gerthk以外，我国山东大学的微生物技术国家重点实验室也在研究。其中，吴斌辉等以纤维堆囊菌Soce9733-1作为研究对象，液体摇瓶发酵用Ck6培养基。结果表明纤维堆囊菌对可溶性淀粉、木聚糖、纤维素等复杂碳源的利用能力较强，简单碳源中只利用葡萄糖；KNO₃、蛋白胨是较好的氮源，大多数氮源都能支持生长，表明该菌营养要求简单，能高效的利用自然界里丰富的纤维素资源。堆囊菌的盐耐受能力较低，盐浓度高于1％的培养基中菌体几乎不能生长，Mg²⁺是生长必需的元素， Ca²⁺对生长没有明显的作用，但是子实体的形态发生所必需的。培养基的起始pH为7.0时细胞生长较好，大于8.0或小于5.0不生长。李越中等以Soce90作为研究对象，以VY/2培养基作为纤维堆囊菌Soce90菌株的培养基，接种于ME培养液中，发酵培养4天左右，结果表明菌体的生长状态对产物的合成有影响，指数期接种物、低氮高碳培养条件、某些盐离子、氨基酸和乙酸盐对epothilones的合成有益，以此获得较为稳定epothilons产量的条件因素。