[发明专利]一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，属于分子信标检测技术领域。

背景技术

传统的分子信标是在发夹结构信标分子两端同时标记小分子，如德克萨斯红（Texas Red）、荧光素（Fluoresein）等作荧光基团，4-(4’-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸（DABCYL）等作猝灭基团。自由状态时，这两类分子靠近（约为7~10 nm），发生荧光共振能量转移，荧光基团发出的荧光被猝灭分子吸收。当检测体系中加入与信标分子碱基相互作用的待测样品（互补的单链DNA/RNA，与信标环适配体区域特异性作用的分子等）后，形成杂交体，信标茎秆互补区被拉开，荧光基团与猝灭基团的距离增大，荧光得到回升。通过检测荧光信号的响应则可对待测样品的含量进行测定。这类分子信标从操作难以程度上来说，可以克服生物分子检测中异相分析手段（如酶联免疫法、化学发光免疫、放射性免疫等）需要洗涤分离的缺点，但是在信标茎两端分别标记两种基团，一般费时费力，价格昂贵。

就已有报道的单标记分子信标体系而言，具有石墨结构的碳材料，如石墨烯/氧化石墨烯、碳纳米管、C60、C70等，由于其所富含的π电子，使之能与分子信标单链DNA上的碱基中芳环结构所赋予的π电子进行π—π堆积，以非共价键结合在一起，因此只需对信标一端进行荧光基团的单标记。但是上述碳材料都较难以制备，多需要购买特殊的制备原料或使用较为复杂的实验条件，制备周期长，成本也不够低；且制备过程或分散过程均要使用有机溶剂，这样会大大降低材料的生物相容性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为克服现有技术的不足，提供一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法。

本发明为解决上述技术问题提供的技术方案为：一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，以碳纳米颗粒为荧光受体，包括以下步骤： 

一种能与核酸信标发生特异性作用的物质的检测方法，以碳纳米颗粒为荧光受体，其特征在于：包括以下步骤： 

 1）配制两组体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液；

2）向第一组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中加入体积不同浓度相同的碳纳米颗粒溶液，得到体积不同的系列混合标准溶液；向每个混合标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合标准溶液的体积相同，孵育30~60 min；然后对每个混合标准溶液进行荧光检测，得到荧光猝灭效率最大时所需的碳纳米颗粒溶液的体积；

3）以第二组一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液中的一个标准溶液作为空白溶液不加入待测样品，其余的标准溶液分别加入相同浓度不同体积的待测样品，得到体积不同的系列混合待测样品标准溶液；然后向每个混合待测样品标准溶液中补加缓冲溶液，使每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育20~120 min；向每个混合待测样品标准溶液中加入与步骤2）中荧光猝灭效率最大时相同体积的碳纳米颗粒溶液，得到系列样品标准溶液，孵育30~60 min，测定每个样品标准溶液的荧光强度，空白溶液的荧光强度为F0，对每个样品标准溶液的荧光强度与空白溶液的荧光强度F0的比值和待测样品的浓度进行标准曲线的绘制；

4）向未知浓度的待测样品中加入与步骤3）中体积相同浓度相同的一端标记过荧光基团的核酸信标的系列标准缓冲溶液并补加缓冲溶液，得到混合待测样品溶液，使该混合待测样品溶液与步骤3）中每个混合待测样品标准溶液的体积相同，孵育20~120min；加入与步骤3）中相同体积的碳纳米颗粒溶液，孵育30~60min后，测定溶液的荧光强度，计算其与步骤3）中空白溶液荧光强度F0的比值，通过标准曲线得到该待测样品的浓度。

所述碳纳米颗粒包括十二烷基苯磺酸钠稳定的碳纳米颗粒或水溶性氧化碳纳米颗粒；所述荧光基团包括有机染料或荧光纳米颗粒。

所述能够与一端标记过荧光基团的核酸信标发生特异性相互作用的物质包括单链核酸或三磷酸腺苷。    

本发明涉及到碳纳米颗粒的制备方法，具体步骤如下：