[发明专利]不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及克隆方法

说明书

技术领域

    本发明涉及一种不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因、其编码蛋白及克隆方法。

背景技术

    氮元素是生物体必须也是需求量最大的矿物质元素，用于合成生物体所需的氨基酸和核苷酸及多种不同的含氮化合物。氮的利用在农作物生产中占非常重要的地位，植物氮代谢及其调控一直备受全世界关注，氮肥利用率低及过量施用氮肥造成水环境污染的问题也是世界性难题。正因为如此，如今需要降低氮肥的使用量，并寻找氮利用率更高的植物基因型。更高的氮利用率可以保证在产量不下降的前提下，减少氮肥的使用量。

    对于生物体的生长和发育而言，氮素的同化是个十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS）是GS-GOGAT氮同化路径上的关键酶，它和谷氨酸合成酶联合作用，催化NH4⁺同化成谷氨酰胺，而谷氨酰胺又在谷氨酸合酶的催化下，将其酰胺转移到α-酮戊二酸上，从而生成两分子的谷氨酸。谷氨酰胺在生物体内含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界的无机氮元素也通过这个途径进入生物体内的整个氮素循环。因此谷氨酰胺合成酶在生物体氮同化过程中起到了十分重要的作用。

    土壤是微生物的大本营，含有种类丰富的细菌类群。来自细菌的谷氨酰胺合成酶涵盖了目前所发现的三大类谷氨酰胺合成酶GSI、GSII和GSIII，相比高等植物的谷氨酰胺合成酶基因而言，有种类多和容易克隆的优越性。不动杆菌（Acinetobacter sp.）是一种常见的土壤细菌，其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于新型氮高效基因的分离并应用于逆境下农作物的生理性状改善有着潜在的重要意义。

发明内容

本发明的目的之一在于提供了一种不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因。

本发明的目的之二在于提供了该基因的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供该基因的克隆方法。

本发明的目的之三在于提供该基因在恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力中的应用。

一种不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因，其特征在于该基因的序列为SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种上述的基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白的序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

一种重组表达载体，该重组载体含有上述的基因。

一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述的重组载体。

一种克隆上述的不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：参考NCBI数据库中的不动杆菌属细菌的谷氨酰胺合成酶基因序列，设计了兼并引物，从土壤微生物宏基因组DNA中PCR扩增得到谷氨酰胺合成酶基因；所述的兼并引物为：

Acneb1F:   5’-ATGAGCATGGCGAACAAGGT-3’；

Acneb1R: 5’-TTACARGCTRTARTACATAT-3’。

上述的不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因的方法，其特征在于所述的PCR扩增的条件为：94℃ 5分钟；94℃ 50秒，48℃ 50秒，72℃ 1分30秒，25个循环；72℃ 8分钟。

    本发明的互补实验验证了不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因Acineb1所编码的谷氨酰胺合成酶能够在大肠杆菌中发挥谷氨酰胺合成酶的功能，能恢复大肠杆菌突变体合成谷氨酰胺的能力，同时也预示了它在其他生物氮高效利用方面的应用价值。

附图说明

图1和图2为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白亚细胞定位预测图，表明该编码蛋白定位在细胞质的可能性很大；

图3为本发明的谷氨酰胺合成酶基因编码的蛋白的进化分析图，表明该编码蛋白属于谷氨酰胺合成酶家族；

图4为本发明的不动杆菌谷氨酰胺合成酶基因在大肠杆菌突变体ET6017(Genotype: F-,[araD139]B/r,Δ(argF-lac)169,flhD5301,Δ(fruK-yeiR)725(fruA25),relA1,rpsL150(strR),Δ(glnG-glnA)229,ha-10,deoC1）中的功能互补分析图。培养基中添加谷氨酰胺，转入Acineb1和未转入Acineb1的菌株均可以正常生长；