[发明专利]一种优秀冰雪运动员内皮祖细胞鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种血管内皮祖细胞鉴定方法，本发明特别涉及优秀冰雪运动员的血管内皮祖细胞的鉴定，属于运动医学、细胞生物学与生物技术交叉领域。 

背景技术

冰雪运动是耐力项目，对心血管系统和呼吸系统功能要求很高。不仅要求有很好的有氧代谢功能，而且还要有较强的负氧能力，所以在选材时要把运动员的心肺功能放在重要因素之内。一般冰雪运动员心肺功能发育良好、心容量大、脉搏有力、每博输出量大、搏动活动频率较低、脉压差较大、脉搏回降迅速、脉活量大等等。一氧化氮作为内皮细胞松驰因子，在心血管系统主要由血管内皮细胞以左旋精氨酸与活性氧分子为底物，在一氧化氮合酶的催化下产生并释放，具有舒张血管、改善冠状动脉功能、增大毛细血管通透性等作用，在运动员运动过程中对调节机体的心血管功能具有重要的生理意义。冰雪运动员由于长期在高氧、高寒地区活动，对心血管功能要求极高，血管壁的内皮细胞更新速度较正常入的高，所以冰雪运动员外周血中内皮祖细胞的含量也比普通人的高。 

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，即能分化为成熟血管内皮细胞的祖细胞，又称血管母细胞(angioblast)或血管内皮干细胞(endothelial stem cells)，来源于骨髓的原始细胞，与人类胚胎时期的成血管细胞(angioblast)和人脐带静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)相似，在一定条件下可诱导分化成为成熟的内皮细胞(endothelial cells，ECs)。1997年，Asahara等人首次分离并证实成年入外周血中存在着能分化为血管内皮细胞的内皮祖细胞，并在体内证实了其生成血管的能力，人们开始了对内皮祖细胞各方面的研究，目前，内皮祖细胞先后从脐血、脂肪、骨髓和胎肝中被分离出来。但是，内皮祖细胞的表面标志与其他干细胞标志极其相似，造成内皮祖细胞的鉴定限制了其在临床医学上的应用。内皮祖细胞细胞表面标志物一般认为CD34+VEGFR-2+CD133+。然而，CD133是造血干细胞的表面标志物，其选择性地表达于早期造血细胞以及骨髓、胚胎肝和外周血的祖细胞，所以单纯用其鉴定不能区分EPCs和造血干细胞，同样CD34和VEGFR-2，它们为造血系和内皮系细胞所共有，也不是必要的EPCs标志。vWF(von Willebrand factor)主要由内皮细胞产生，与内皮素等共同存在于内皮细胞Weibel-Palade小体中，因此Weibel-Palade小体被作为内皮细胞的识别标志。 

发明内容

本发明的目的为提供一种鉴定优秀冰雪运动员内皮祖细胞的方法。 

一种通过透射电子显微镜观察细胞器Weibel-Palade小体从而鉴定内皮祖细胞的方法。 

在电子染色过程中，本发明对染色温度进行了改进，采用37°染色30s，节约了染色时间，提高了染色效率。 

具体实施方式

(一)优秀冰雪运动员外周血CD34+内皮祖细胞细胞分离培养 

无菌采集优秀冰雪运动员外周血40ml，肝素抗凝，用Hakn’s液等倍稀释血液。 

然后采用Fiocll密度梯度离心法分离。方法如下： 

(1)在离心管中加入淋巴细胞分离液； 

(2)取肝素抗凝血与等量Hanks液充分摇匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，水平离心，2000rpm，20min； 

(3)离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核红饱包括淋巴细胞、内皮祖细胞和造血干细胞。 

(4)用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞，植入另一离心管中，加入5倍以上体积的Hanks液，离心，1500rpm，10min，洗涤细胞2次。 

(5)末次离心后，弃上清，加入含有，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2％台酚兰染液混合，于血球计数板上，计算细胞活率。 

(6)将收集的单个核细胞与CD34单克隆抗体孵育1h后，1200rpm离心洗涤2次，流式细胞仪分选CD34+细胞。 

(二)优秀冰雪运动员外周血CD34+细胞体外富集 

(1)培养板及培养瓶的的包被 

取10ml 1％明胶加入培养板和培养瓶，放入37℃培养箱中孵育2h取出，吸出多余的液体备用。 

(2)CD34+细胞传代培养