[发明专利]一种优秀冰雪运动员羊膜间充质干细胞分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种优秀冰雪运动员羊膜间充质干细胞(Amniotic Mesenchymal Cells，AM-MSCs)分离方法，具体地说是利用多种酶联合消化法获得纯度非常高的羊膜间充质干细胞。属于细胞生物学与运动生理学、运动医学交叉学科与领域。

背景技术

2002年，美国学者Kaviani A发现胎盘中含有丰富的繁殖力极强的间充质细胞，提出了胎盘作为胚胎组织工程的细胞资源的设想。胎盘组织的特点之一就是它能够通过主动和被动免疫机制来逃避母系的排斥。随后，许多学者开始对胎盘干细胞进行深入研究。In’s Anker等用机械法成功从人羊膜分离到间充质干细胞，他们经组织相容性复合物抗原分型检测全部为胎儿源性。经检测后鉴定为AM-MSCs。Tamagawa等第一次证实了羊膜干细胞可向三胚层分化的多潜能性。又有学者发现，培养的AM-MSCs除表达神经干细胞的特异性标志蛋Nestin外，还表达干细胞特异性转录因子八聚体连接蛋白4(octamer-binding protein4，Oct-4)，进一步证实羊膜中存在多分化潜能的羊膜干细胞。人类羊膜的采集多在胎儿出生后，将废弃的胎盘作为实验材料，故不涉及伦理方面问题。且取材相对容易。

Tamagawa等将人的羊膜上皮和间充质细胞与鼠的胚胎细胞融合形成体外异基因嵌合体，第一次提出来自羊膜的细胞具有多分化潜能的假设。随后一些研究者，研究并证实了来自羊膜具有多分化潜能的细胞是羊膜上皮干细胞，并研究了其的生物学特性及其有向三胚层分化的潜能。

胰酶和其它消化酶的作用次序不同，有不同的方法从羊膜中分离培养AM-AMSCs。通常AM-AMSCs用L-DMEM，5-10％FBS，bFGF培养。新分离培养的AM-AMSCs用吉姆萨染色可见细胞呈中等大小，中心有一到两个核仁，大量胞质，通常可见空泡。细胞呈有丝分裂增殖，具有纺锤样细胞形态。在培养过程中低密度接种也会使细胞过早分化衰老。

羊膜间充质干细胞除表达胚胎干细胞表面抗原：SSEA-3和SSEA-4，肿瘤抗性基因TRA1-60和TRA1-81之外，近来发现AM-AMSCs还表达多潜能干细胞的转录因子，例如Oct-4，Sox-2，Nanog和REX-1等及其它抗原。

AM-AMSCs在合适的诱导条件下可以向三胚层诱导分化。有人通过RT-PCR对神经组织(外胚层)的特异性基因检测，发现AM-AMSCs诱导前后均表达，但在AM-AMSCs诱导7天后，Nestin表达量增加，细胞拉长呈神经细胞样形态，经免疫细胞化学检测，MAP₂(神经元结构蛋白微管相关蛋白2)和GFAP(神经胶质纤维酸蛋白)阳性表达。目前此研究已经进入帕金森疾病及VII型疾病的动物模型治疗中。与此同时，用相同的方法也证实了AM-AMSCs有向胰脏细胞、肝脏(内胚层)分化潜能，及心肌细胞(中胚层)的分化潜能。

AM-AMSCs在合适的培养条件下高密度和长期培养，呈同心圆向四周放射型生长，与胚胎细胞相类似。这些细胞维持了干细胞的特性，他们不需要其它细胞提供的营养物质支撑，仍然能表达Oct-4，Nanog，而不表达端粒酶，呈现正常的核型。移植以后无致瘤性。所有这些与胚胎细胞相反，胚胎细胞有很高的端粒酶活性，培养时非整倍性扩增，在小鼠实验中将其注入形成畸胎瘤。

发明内容

本发明的一个目的是提供优秀冰雪运动员羊膜间充质干细胞简单易行的取材方法，采取以下技术方案：

1、取材：经调查、跟踪优秀女性冰雪运动员，(签署知情同意书经其本人允许，所有操作符合伦理道德标准)在其分娩后获得其胎盘羊膜等组织，4℃保存样本迅速将羊膜剥离，并将羊膜组织放入含有青霉素、链霉素、两性霉素B的PBS中反复清洗，在清洗的同时剥离羊膜周围附带的血管及其他结缔组织，直到羊膜清洗到透明无其他杂质，将羊膜剪成4-5cm×4-5cm的方块，放入培养皿中平铺整齐；

2、贯序消化：胰蛋白酶消化法，其目的是去除羊膜上的羊膜上皮细胞避免后续分离羊膜间充质干细胞中其在中夹杂影响细胞纯度，第一步：在培养皿中加入3ml0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA放置于37.5℃恒温摇床震荡消化5min后弃掉消化液，第二步：继续向培养皿中加入3ml的0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化液，消化5min后弃掉消化液，第三次向培养皿中加入3ml的0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化液消化5min后弃掉消化液并用预热后的PBS冲洗几遍后，观察发现羊膜组织已经被消化成为胶冻样物质；