[发明专利]南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。

背景技术

南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei）为裸子植物亚门（Cymmospermai）松杉纲（Coniferopside）红豆杉目（Taxales）红豆杉科（Taxaceae S.F.Gery）红豆杉属（Taxus Linn.）植物，是中国红豆杉属植物中分布最为广泛的一个种,自然分布于亚热带各省区。红豆杉树皮中因含有抗癌药物成分紫杉醇导致其被大量砍伐或破坏，现已处于濒危状态，在1999年我国国务院公布的《国家重点保护植物名录（第一批）》中被列为国家一级保护植物。南方红豆杉材质优异，是高档珍贵用材，其紫杉醇含量虽稍低于喜马拉雅红豆杉等，但因早期速生、生物收获量大，适宜短周期作业而具有巨大的药用开发利用价值。

SSR（简单重复序列，又称微卫星DNA，Simple Sequence Repeats或Microsatellite DNAs）标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在鉴定上显示了独特的优越性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享；且操作简便、稳定性、重复性好。已成为目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。

因此，建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供优化的南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，所述反应体系总体积20uL，其中，上、下游引物各2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg²⁺1.0mM和模板DNA 75ng，以ddH₂O配制。

其中，上游引物F：5′-TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3′；下游引物R：5′-CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3′。

PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；60℃ 30min。

其中，模板DNA的提取包括以下步骤：

（1）取-70℃保存的南方红豆杉嫩叶0.5～1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末；

（2）将粉末快速转移到2mL离心管中，加入1mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30～45min。其间不时摇动离心管使之混匀；

（3）取出离心管，4℃ 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；

（4）加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和异戊醇混合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1）轻轻地颠倒混匀，放置10min，4℃ 12000rpm离心10min；

（5）重复步骤（4）；

（6）吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；

（7）4℃ 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500μL去离子水和2μL  RNase溶解DNA，并于37℃水浴30min-1h；

（8）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇（即氯仿和异戊醇的混合液，二者体积比为24：1）抽提一次；

（9）沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50μL去离子水；

（10）1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20℃保存。

本发明还提供所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的应用。