[发明专利]南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用

权利要求书

1.南方红豆杉SSR-PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积20uL，其中，上、下游引物各2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg²⁺1.0mM和模板DNA 75ng，以ddH₂O配制；

其中，上游引物F：5′-TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3′；下游引物R：5′-CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3′。

2.根据权利要求1所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃ 5min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；60℃ 30min。

3.根据权利要求1或2所述的SSR-PCR反应体系，其特征在于，模板DNA的提取包括以下步骤：

（1）取-70℃保存的南方红豆杉嫩叶0.5～1g，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨成粉末；

（2）将粉末快速转移到2mL离心管中，加入1mL 65℃预热的CTAB提取液，充分混匀，65℃水浴30～45min。其间不时摇动离心管使之混匀；

（3）取出离心管，4℃ 12000rpm离心10min，取上清到新离心管中；

（4）加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇轻轻地颠倒混匀，放置10min，4℃ 12000rpm离心10min；其中，Tris平衡酚、氯仿、异戊醇的体积比为25：24：1；

（5）重复步骤（4）；

（6）吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的-20℃预冷无水乙醇和1/10体积醋酸钠，混匀，-20℃放置30min以上，沉淀DNA；

（7）4℃ 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500μL去离子水和2μL RNase溶解DNA，并于37℃水浴30min-1h；

（8）溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇抽提一次；其中，氯仿、异戊醇的体积比为24：1；

（9）沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50μL去离子水；

（10）1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，-20℃保存。

4.权利要求1-3任一项所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的应用。