[发明专利]二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法，尤其是在制备基于多肽自组装纳米线作为电子媒介体的葡萄糖电化学生物传感器上的应用方法。

背景技术

自克拉克和里昂开发出将酶固定于电极表面的检测方法以来（Annals of the New York Academy of Sciences,1962,102,29-45），酶传感器得到了迅速发展。近十年来，虽然不同种类的生物传感器和检测器件相继被开发出来，但葡萄糖生物传感器的进一步完善和商业化依然是国际上生物传感器研究领域的热门。血糖的实时监控对于糖尿病患者病情控制意义重大，现今血糖测试仪已使糖尿病患者可在家中自行测定血糖值。

将葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，简称GOx）和电子媒介体二茂铁（ferrocene，简称Fc)固定于工作电极上，当在检测体系中加入血样后，血液中的葡萄糖被GOx氧化。Fc具有优良的电化学活性，可起到增强电子传递、放大信号作用。通常分步将GOx和Fc固定到电极上，步骤较繁琐且影响传感器的重现性。因此，我们考虑制备一种纳米复合材料同时包含Fc和GOx，这样只需一步，将此纳米材料固定在电极上即可完成葡萄糖传感器的制备。

近年来，自组装多肽纳米材料因其良好的生物相容性、简单的自组装过程以及易于功能化等特点而备受关注（Journal of the American Chemical Society,2010,132,15632-15636）。在已报道的多种多肽分子中，二苯丙氨酸（diphenylalanine，Phe-Phe，简称FF）及其衍生物因其分子结构简单而得到研究工作者青睐。在不同条件下，FF可自组装形成纳米管、纳米线，纳米颗粒等。这类纳米材料表面的氨基或羧基使其可进行多样的化学修饰，从而应用于构造复杂纳米器件、作为药物载体以及制备生物传感器。

发明内容

本发明的目的是提供一种二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物及其制备和应用方法。本发明首次基于二茂铁-二苯丙氨酸（Fc-Phe-Phe-OH）通过共价键、氢键等作用自组装形成的二茂铁多肽纳米线（Fc-Nano Peptide Wires，简称Fc-PNWs），并结合葡萄糖氧化酶，得到Fc-Nano Peptide Wires-GOx，简称Fc-PNWs-GOx，再由此制备了测定血糖的电化学生物传感器。该传感器灵敏度高，检测限低且制备方法简单。

二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物的制备方法，包括以下任一方式所述的步骤：

称取二茂铁-二苯丙氨酸溶于乙醇，待溶剂挥发后，二茂铁-二苯丙氨酸逐渐析出并且自组装形成线型纳米材料A；将A加入蒸馏水中，在超声仪中超声震荡，使A由团聚状态分散开来得到B；取壳聚糖溶液与B混合，震荡超声后放置，使壳聚糖分子充分修饰到纳米线表面得到C；将C离心，移除上层溶液，然后至少重复进行两次加pH=7.4的磷酸缓冲溶液、离心和移除上层溶液的过程后滴入戊二醛的水溶液，形成混合物后震荡，然后离心得到D；向D中加入葡萄糖氧化酶水溶液，震荡，放置，即制成二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物；

或者

称取二茂铁-二苯丙氨酸溶于乙醇；待溶剂挥发后，二茂铁-二苯丙氨酸逐渐析出并且自组装形成线型纳米材料A；将A加入磷酸缓冲溶液，在超声仪中超声震荡，使A由团聚状态分散成单条纳米线状态，然后离心，再次加入磷酸缓冲溶液，离心，移除上层溶液，得到E，分别取壳聚糖溶液，戊二醛水溶液和葡萄糖氧化酶水溶液，加入E中配成二茂铁-二苯丙氨酸溶液，震荡超声，放置，即制成二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物。

上述方法具体如下：

称取二茂铁-二苯丙氨酸溶于乙醇，配成2～5mg/mL的溶液；待溶剂挥发后，二茂铁-二苯丙氨酸逐渐析出并且自组装形成线型纳米材料A；称取A2mg加入1mL蒸馏水，在超声仪中超声震荡3～5分钟，使A由团聚状态分散开来得到B；取1mL质量分数1%的壳聚糖溶液与B混合，震荡超声2分钟后放置3小时，使壳聚糖分子充分修饰到纳米线表面得到C；将C离心，离心转数为5000转/分钟，离心5分钟，移除上层溶液，然后重复进行两次加pH=7.4的磷酸缓冲溶液、离心和移除上层溶液的过程后滴入500μL0.25%的戊二醛的水溶液，形成混合物后震荡半小时，然后离心得到D；按照二茂铁-二苯丙氨酸2mg/mL的配比，向D中加入10～15mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液，震荡2-5分钟，放置24h，即制成二茂铁多肽纳米线-葡萄糖氧化酶复合物；

或者