[发明专利]检测叶酸的酶联免疫试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测叶酸的酶联免疫试剂盒，其特别适于成品奶、奶粉和谷物（大米、小米、玉米、黄豆、面粉等）中叶酸含量的检测。

背景技术

叶酸（Folic Acid）是由喋呤啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸等组成的化合物，是一种水溶性B族维生素。叶酸对人体有重要营养作用，缺乏叶酸可引起巨红细胞性贫血以及白细胞减少症，还会导致身体无力、易怒、没胃口以及精神病症状。此外，叶酸对孕妇尤其重要，如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿、无脑儿的发生率。现在叶酸的作用正逐渐被人们所认识，许多国家已经在人们日常饮食中有意识地添加叶酸，2009年6月21日卫生部宣布启动6项公共卫生项目，增补叶酸预防神经管缺陷项目，这就为叶酸的检测提出了较高的要求。

目前叶酸检测方法包括：气相色谱质谱法(GC-MS)、液相色谱串联质谱法(LC-MS-MS)、液相色谱法、比色法、薄层层析法、微生物法和同位素放射免疫法等，仪器法灵敏、准确，特异性强、分离度好，可以同时测定多种药物，但需要昂贵的仪器、样品的前处理复杂、繁琐费时、检测的成本较高，不能现场操作，而且需专业人员操作，所以限制了其应用。与之相比，酶联免疫方法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测等优点，而且所需设备少，操作简单易学，成本低廉，能够更好地满足我国食品企业、政府职能监管部门等开展检测工作。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结构简单、使用方便、价格便宜、便于携带的用于叶酸检测的酶联免疫试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测方法。

本发明试剂盒，它包括：包被有包被原的酶标板、叶酸特异性抗体、酶标记物、叶酸标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液，所述包被原为叶酸偶联抗原，所述酶标记物为酶标记抗抗体。

所述叶酸偶联抗原是由叶酸与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

所述叶酸特异性抗体是以叶酸偶联抗原作为免疫原制备获得，所述叶酸特异性抗体可为叶酸单克隆抗体或叶酸多克隆抗体，其中优选叶酸单克隆抗体。

所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，其中优选羊抗鼠抗抗体。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括叶酸标准品溶液、底物显色液、终止液、洗涤液、复溶液。

所述叶酸标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物显色液由底物液A液和底物液B液组成，A液为过氧化氢或过氧化脲，B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，所述终止液为1~2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，所述底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述终止液为1~2mol/L氢氧化钠溶液。

所述洗涤液优选为pH值为7.4，含有0.5%~1.0%吐温-20、生物防腐剂、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

所述复溶液的pH值为7.0，含有磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，氯化钠，氯化钾。

其中在酶标板制备过程中所用到的包被缓冲液为pH值为9.6，0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，封闭液为pH值为7.1~7.5，含有1%~3%酪蛋白、0.1~0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成20μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育2h或4℃过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150~200μl封闭液，37℃避光孵育1~2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明的检测原理为：

在微孔条上预包被叶酸偶联抗原，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入叶酸特异性抗体溶液，样本中的叶酸与酶标板上包被的叶酸偶联抗原竞争抗叶酸特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光度值与叶酸的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得到样本中叶酸的含量；同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中叶酸含量的浓度范围。