[发明专利]胶束电动毛细管电泳法测定吡咯并喹啉醌二甲酯含量的方法

说明书

技术领域

一种胶束电动毛细管电泳法测定吡咯并喹啉醌二甲酯含量的分析方法，属于色谱分析技术领域。

背景技术

大量研究表明，在动物体内，朊蛋白病变主要集中在良性细胞蛋白PrP-sen到病毒蛋白PrP-res的转变过程，蛋白结构转变过程中伴有神经元的死亡，引发中枢神经系统不可逆致命性的神经退行性疾病。

文献报道富含电子的芳香族和聚阴离子的化合物能通过捕捉朊自由基或与含氧反应中间体形成离子键，抑制致病蛋白PrP-res的复制而成为脑精神疾病的潜在药物。其中富含电子的芳香族化合物有:蒽螺旋(anth racycline，一种共轭二醌)、富含电子的聚阴离子化合物有：染料刚果红多阴离子等[1：杨池明，脑神经退行性疾病中的有机化学，高等学校化学学报，2002,23（2）:243-250.]。

吡咯并喹呤醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ），结构式如式1所示，是一种氧化还原酶辅基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中。PQQ对NMDA受体（N-甲基D-天门冬氨酸受体）介导的兴奋性神经毒具有神经保护作用。它可以与NMDA受体的甘氨酸、氧化还原等位点发生作用，能够减少神经细胞的死亡，在脑中有促进神经因子产生和神经保护作用，并具有提高认知功能等作用。PQQ在神经系统方面的重要功能可能与其对神经递质氨基酸的调节作用有关。

吡咯并喹啉醌二甲酯(4,5-二氧-4,5-二氢化-1氢-吡咯【2,3-f】喹啉-2,7,9-三羧酸-2-乙酯-7,9-二甲酯，PQQZ)，结构式如式2所示，具有与PQQ相似的共轭二醌的结构，是合成PQQ的中间体，PQQZ水解制备得到PQQ。要得到高纯度的PQQ，必须严格控制PQQZ的纯度，因此，PQQZ的含量分析显得十分重要。

     

PQQ具有参与呼吸链电子传递功能，在人体内通过葡萄糖的作用能促进氨基酸的吸收。PQQ能够与氨基酸发生反应生成恶唑类化合物因而对神经递质具有调节功能。已有文献研究了PQQ与神经递质氨基酸的作用[2：Xingqin Zhou*，Xiaofeng Qin，Guoxian Cao，Jiankang Zhang，Ion-Pair LC Analysis of Pyrroloquinoline Quinone in Neurotransmitter Amino Acid Incubations:Determination of Chemical Kinetics.Chromatographia(2012)75:521–526.][3：周杏琴*，钦晓峰，张建康，离子对色谱法研究吡咯并喹呤醌与D-丝氨酸反应的化学动力学，色谱，2012，30（2）196-200.]。PQQZ具有电中性，普通的高效液相色谱等分析方法较难达到理想的分离。本发明首次采用胶束电动毛细管电泳（MECC），以表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）加入到缓冲液体系形成胶束，并加入有机改性试剂，使PQQZ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离，分析了吡咯并喹啉醌二甲酯的纯度，同时采用二极管阵列检测器考察了吡咯并喹啉醌二甲酯与D-丝氨酸（D-Serine）的化学反应。D-Serine是NMDA受体上Gly位点的一种内源性配基，作为中枢神经系统重要的神经递质结合NMDA受体，在NMDA受体的生理和病理过程中发挥重要的作用。许多神经系统退行性疾病都与D-Serine代谢有关。通过分析PQQZ与D-Serine的化学反应分析PQQZ是否同样对氨基酸具有调节作用，了解PQQZ是否对神经元具有保护作用，为药物设计提供实验依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胶束电动毛细管电泳法测定吡咯并喹啉醌二甲酯含量的分析方法，使PQQZ与其他较难分离的电中性杂质达到高效快速的分离。

本发明的技术方案：一种胶束电动毛细管电泳法测定吡咯并喹啉醌二甲酯含量的方法：

（1）毛细管选择及预处理：

选用未涂层的42cm×50μm石英毛细管柱；新毛细管先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，1mol/L NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10-15min；每次进样前，用蒸馏水及运行缓冲液先后冲洗2min；

运行缓冲液及样品溶液均用0.22μm微孔针头过滤器过滤；

（2）电泳分析条件：

检测波长为250nm，进样方式为0.5psi压力进样，进样时间10.0sec，分离电压为22kv，毛细管柱温25℃；