[发明专利]以抗生素为碳源生长的土壤微生物的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以抗生素为碳源生长土壤微生物的分离方法。

背景技术

抗生素是二十世纪人类最伟大的发明之一，它能杀灭或抑制病原微生物，在保障人类健康中作用巨大。自 Alexander Fleming于1928年发现青霉素(Penicillin)以来，各种天然、合成、半合成的抗生素被大量开发并投入市场。在我国，数据显示我国药物处方中抗生素占70%，与西方国家30%比例相比，反映了我国抗生素滥用情况严重，近年来我国饲用抗生素年平均消费已达6000吨。由于抗生素的大量使用使许多细菌获得了耐药性，导致抗生素的冶疗效果日益下降。近年来，越来越多的抗生素进入环境已成为不争的事实，导致环境中的抗生素浓度升高，从而诱导抗性基因，这些抗性基因具有很高的迁移性和活性，可通过可移动遗传元件，如质粒、转座子、整合子及基因组岛等，在同种甚至于不同种菌株间水平转移，使得抗性基因在环境中广为传播，造成二次污染，而且以这种方式获得的抗药性机率高，形成后较稳定，是引起抗药性传播的主要原因。传统对抗性基因的研究采用选择性培养基进行富集培养的方法，分离得到的菌通常称为抗生素耐受菌。研究已经证明了许多细菌能够在极端环境下生长，而且能够降解毒性的物质。因此，环境中必然会有一些菌不仅能对抗生素起耐受作用，而且能以抗生素为碳源进行生长。如果能分离出以上菌，有利于促进国内开展抗生素抗性以及抗性基因相关方面的研究，进而研制新的抗菌药物，减少抗性带来的负面影响提供参考。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低廉、操作简便、分离效果好的以抗生素为碳源生长的土壤微生物的分离方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种以抗生素为碳源生长的土壤微生物的分离方法，包括以下步骤：

1）、制备单一碳源介质：

溶解5 g (NH₄)₂SO₄, 3 g KH₂PO₄, 0.5 g MgSO₄.7H₂O, 15 mg EDTA, 4.5 mg ZnSO₄.7H₂O, 4.5 mg CaCl₂.2H₂O, 3 mg FeSO₄.7H₂O, 1 mg MnCl₂.4H₂O, 1 mg H₃BO₃, 0.4 mg Na₂MoO₄.2H₂O, 0.3 mg CuSO₄. 5H₂O, 0.3 mg CoCl₂.6H₂O 和 0.1 mg KI至900ml蒸馏水中，用0.1mol/L NaOH溶液调pH至6.2~6.4，用蒸馏水定容至1000ml；得液态单一碳源介质；

2）、制备液体抗性培养基和固体抗性培养基（即，制备单一碳源抗性培养基）：

在液态单一碳源介质中加入青霉素直至青霉素的浓度为0.8~1.2g/L，过0.22μm滤膜；得液体抗性培养基；

在500mL的液态单一碳源介质中加入7.5克琼脂后灭菌（为常规的高温高压灭菌，即，121℃、102.9 kPa灭菌20 min），冷却至40~50℃（例如为45℃）后，加入经过0.22μm滤膜的青霉素溶液（例如为青霉素的饱和溶液，去离子水为溶剂）直至所得的液态物中青霉素的浓度为0.8~1.2g/L；所得的液态物冷却后，得固体抗性培养基；

备注说明：将大约15 ml的上述液态物倒入培养皿中，盖好皿盖，轻轻摇动培养皿，使液态物均匀分布在培养皿底部，在桌面上冷凝成平板，得固体抗性培养基；备用；

3）、制备土壤稀释液：

称1g土壤放入盛有49 mL磷酸盐缓冲液（pH7.2，0.01M ）的容器中，在摇床上（100~200rpm）振荡20~40min（例如为30min）；得菌悬液；

用液体抗性培养基将菌悬液稀释至菌悬液的体积浓度为0.1%的土壤稀释液；

以上操作在超菌台中完成（即，整个步骤3）在超菌台中完成）；

4）、倒置培养：

在超菌台上，将土壤稀释液涂布在固体抗性培养基上（备注说明：相对于15 ml的液态物制备而得的固体抗性培养基，土壤稀释液的用量为0.1mL）；