[发明专利]一种用于BACE1抑制剂筛选的电化学方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于BACE1抑制剂筛选的电化学方法，属于药物筛选领域。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，患者大脑内β-淀粉样蛋白(β-amyloid Protein,Aβ)沉积形成的老年斑是其主要病理特征。目前大部分研究表明Aβ的异常表达与AD的发生存在密切关系。因此，从源头上减少Aβ的产生成为预防和治疗AD的主要手段。

Aβ是由跨膜蛋白β-淀粉样前体蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)经β-和γ-分泌酶切割而成的。因此，抑制β-分泌酶的生物活性在一定程度上会减少Aβ的产生及随后Aβ的聚集，从而对AD的发生、发展起到预防作用。由于APP是一个分子量较大的跨膜蛋白，采用短链的目标多肽序列来模拟β-分泌酶对APP的切割行为以及筛选抑制β-分泌酶活性的抑制剂具有重要的研究意义。

因此，寻找有效抑制β-分泌酶活性的药物是当前研究热点之一。目前抑制剂主要是从多种人工合成或天然的药物分子中筛选出来的，尽管体外实验表明这些分子能够与β-分泌酶相互作用，抑制酶的活性，但是目前并没有临床实验表明这些分子可用于AD的治疗。此外，上述抑制剂存在的问题是分子尺寸较大，亲油性较差，很难穿透血-脑屏障。针对这些问题，人们倾向于从药库或天然产物中寻找一些药物分子用于抑制β-分泌酶的活性。已报道的方法，如荧光共振能量转移（FRET），主要是通过对药物或母体分子（APP中的片段）进行荧光标记来筛选抑制剂。但是荧光基团标记的多肽合成比较复杂，且标记基团的大小会影响多肽构型；此外，采用荧光标记来筛选抑制剂的方法步骤繁琐、周期长，且荧光基团易发生光漂白、稳定性较差，因此很难从成千上万种药物分子中筛选出有效的酶抑制剂。

发明内容

本发明针对目前荧光共振能量转移（FRET）筛选β-分泌酶抑制剂的方法步骤繁琐、周期长，且采用荧光标记时荧光基团易发生光漂白、稳定性较差，从而导致不能进行药物分子的有效筛选等一系列问题，提供一种灵敏度高、步骤简单、操作简便、快捷，能同时筛选多种BACE1抑制剂的电化学方法。

本发明提供了一种用于BACE1抑制剂筛选的电化学方法，该方法是把生物素标记的多肽分子组装在金电极的表面后，将金电极的表面封闭；用上述封闭了表面的金电极在待筛选的BACE1抑制剂和BACE1存在的条件下进行抑制酶切反应；再将巯基二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物衍生到抑制酶切反应完成后得到的金电极的表面，并用衍生所得到的金电极通过电化学检测进行BACE1抑制剂的筛选。

所述BACE1抑制剂的筛选是将至少3根组装了生物素标记的多肽分子并封闭了表面的金电极置于浓度为5～15nM的BACE1与不同浓度的待筛选的BACE1抑制剂的混合液中进行抑制酶切反应；在抑制酶切反应完成后所得到的金电极的表面衍生巯基二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物，再进行电化学检测；通过电化学响应确定抑制效果和抑制剂浓度的关系，并用IC₅₀值来判定待筛选的BACE1抑制剂的抑制效果，进行BACE1抑制剂的筛选。

所述的BACE1抑制剂的筛选至少需做3组不同浓度的待筛选的BACE1抑制剂的抑制酶切反应实验，直到能确定待筛选的BACE1抑制剂的抑制效果和抑制剂浓度的线性关系。

所述的IC₅₀为抑制剂的抑制效果达到最高的一半时的浓度。

所述的抑制酶切反应的反应条件是在37℃的环境中反应30～90min。

所述的BACE1用pH为4～5的HAc-NaAc缓冲液溶解，BACE1抑制剂用DMSO溶解。

所述巯基二茂铁修饰的纳米金/抗生物素蛋白复合物通过如下方法获得：将HS-(CH₂)₆Fc超声溶解在正己烷中,在上述溶液中加入PBS稀释的纳米金/抗生物素蛋白复合物，在800～1200rps的转速下摇动20～28h，离心弃去有机相和水相，即得。

所述的PBS的pH为7～7.5。

所述的封闭是将组装了生物素标记的多肽分子的金电极先用0.1mM的HT浸泡4～10min，再用1%的BSA浸泡0.5～1.5h。

所述的生物素标记的多肽分子易溶于水。

所述生物素标记的多肽分子序列为Bition-KTEEISEVN LDA EFRHDKC（可在Sigma-Aldrich、上海生物工程有限公司、北京鼎国昌盛生物技术有限公司、上海强耀生物科技有限公司等厂家购买）。