[发明专利]多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，更具体地说，本发明涉及一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺。

背景技术

多肽传统的氧化方法是在树脂上把序列合成完后，用酸把产物裂解下来，然后用空气氧化或者DMSO氧化，或者双氧水或者典等氧化的方法。传统氧化方法存在以下缺点：空气氧化和DMSO氧化缺点是溶剂体积太大，氧化时间过长，一般是1mg产物对1毫升的溶剂，最后都要有几百毫升的体积，氧化好后还要去除溶剂然后再纯化。而且这两种多肽氧化方法耗时很长，一般氧化用时2天左右，除溶剂也要两天左右。所以在整个生产过程中，氧化这一步骤就要占用很大的比例。双氧水或者碘氧化的方法虽然用时比较短，但是都有局限性，序列中如果含有甲硫氨酸或者天门冬氨酸就不能用双氧水这种强氧化剂氧化，而且他对溶剂的酸碱度等也有要求。碘氧化步骤比较繁琐而且产率不高，氧化后要马上处理否则样品会有变的可能性。二硫键环化多肽也有固相环化的方法，既一般是用特殊的巯基保护基(比如ACM，MMT等)在多肽序列合成完后用特殊物质去除巯基的特殊保护，然后在树脂上氧化，这样的好处是氧化完成后直接切割拿到的产物就是所需要的最终产物，节约了大量的人力物力。上述的方法大部分只能合成单个二硫键的环化，对于目前比较复杂的多对二硫键的多肽的合成则没有什么优势，本发明涉及多对二硫键的定点环化固相合成多肽的新工艺。其中运用了低成本环保的单保护的多肽二硫键环化固相技术和传统的特殊巯基保护基的二硫键环化技术。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺。

本发明的目的是通过下述技术方案实现的：

一种多对二硫键定点环化固相合成多肽新工艺，所述的新工艺亦称树脂上氧化工艺，所述的新工艺按如下具体步骤如下：

第一步，由于需要多对二硫键，所以适宜的多肽序列含有四个以上半胱氨酸残基，将要配对的半胱氨酸残基进行编号；

第二步，将配对的半胱氨酸残基选择一对用单保护的半胱氨酸，一对用H-Cys(Acm)-OH，一对用H-Cys(MMT)-OH；

第三步，应用多肽固相合成技术将多肽序列固定在固相载体上，其中对应的半胱氨酸残基采用单保护或者用H-Cys(Acm)-OH或者用H-Cys(MMT)-OH；

第四步，序列合成完成后，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，然后添加氧化剂，将序列中两个单保护的半胱氨酸残基的-SH氧化，形成二硫键；

第五步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂；

第六步，将树脂加入含有1％的脱除剂的有机溶剂的容器中，进行其中两个半胱氨酸残基保护基的特异性去除；

第七步，用砂芯滤柱过滤溶剂用ELLMAN试剂检测，用纯DCM和DMF清洗树脂；

第八步，将树脂载体浸泡在有机溶剂中，添加氧化剂，将已去除-HS保护基的两个半胱氨酸残基的-SH氧化，形成二硫键；

第九步，用砂芯滤柱过滤掉溶剂，用纯DCM和DMF清洗树脂；

第十步，用ELLMAN试剂检测，查看反应是否完全，对比本发明和常规工艺的两对二硫键氧化肽合成的优劣。

与现有技术先比，本发明具有以下有益效果：

节省时间、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明的实质性内容作进一步的详细描述：

经过实验验证本氧化方法在多肽固相有机合成中的实用性、有效性和先进性。

实施例：

合成一条序列为DKCYGLACASCEFEPCLL的肽，序列中两端两个半胱氨酸之间形成一对二硫键，中间两个半胱氨酸之间形成一对二硫键。原理：通过载体固定序列的羧基端，按照顺序合成，待合成完序列后在把序列从载体上裂解下来之前，让序列中两个半胱氨酸上的巯基通过一定的技术手段形成二硫键，并计算收率。

准备工作：配置茚三酮检测试剂20ml，20％的六氢吡啶脱帽液，DMF，DCM，甲醇，配置好的三氟乙酸裂解液。

其它原料：Fmoc-Leu-wang树脂，HBTU，DIEA，Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Cys-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Glu(Otbu)-OH，Fmoc-Ser(Tbu)-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Asp(Otbu)-OH，Fmoc-Cys