[发明专利]用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌及发酵剂

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵领域，涉及用于甾体类化合物高效转化（A环1,2位脱氢）的简单节杆菌，尤其是一种用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌及发酵剂。

技术背景

甾体类药物具有重要的生理活性，在临床上有广泛的应用，是仅次于抗生素的第二大类药物。醋酸可的松C1,2位上导入双键后成醋酸泼尼松，抗炎作用能够提高3-4倍，并且减少由钠滞留而带来的副作用。目前甾体药物生产中常用的方法有化学合成和微生物转化两种，化学方法进行C1,2位脱氢一般采用二氧化硒法，该方法常使产品中带有少量难以除尽对人体有害的硒，微生物转化法具有成本低、对环境温和等优点，越来越受到人们的重视。

简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)的C1,2位脱氢反应是工业生产醋酸泼尼松及其同系物最有价值的一种反应，也是采用发酵法工业生产甾类药物的典型代表。目前甾体微生物转化主要研究的领域主要在以下几个方面：提高水不溶性底物的溶解度，细胞和酶的固定化以利于酶的重复利用，发展经济有效的产物连续回收方式等用来提高产量，但是寻找、筛选更优良菌种来提高转化率才是更加长期有效的方法。目前国内在这步反应中仍在使用原始菌株，很少在分子水平上进行深入的探索，尚无基因工程菌研发成功，这也限制了国内甾体药物生产的进一步发展。随着分子生物学的发展和人们对甾体代谢机制研究的深入，基因工程菌在甾体药物生产中必将得到广泛的应用。

Choi等（1995,Journal of bacteriology1779（5），4152-4156）描述了简单节杆菌(Arthrobacter Simplex)菌株中C1,2位脱氢基因（KsdD）的基因序列、成功的将此基因异源表达于链霉菌并研究了此酶的性质，但并未对简单节杆菌本身进行分子改造，简单节杆菌本身的遗传背景不清楚，通过同源重组构建高效生物转化简单节杆菌还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌及发酵剂，本发明通过基因工程技术，对简单节杆菌进行同源重组，利用质粒pXJM19上携带的氯霉素抗性基因的启动子启动A环1,2位脱氢酶目的基因转录，实现A环1,2位脱氢酶在出发菌中高水平表达。

本发明的另一个目的是利用该工程菌株进行生物转化方法改进，使工程菌的转化效率达到最高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌，所述基因工程菌的宿主菌为简单节杆菌（Arthrobacter Simplex），保藏编号为ACCC 12070，所述基因工程菌内含有如序列10所述的重组基因片段。

而且，所述基因工程菌的发酵底物包括醋酸可的松、含氟皮质激素、4-AD。

而且，所述基因工程菌的培养基为：酵母提取物5wt%-8wt%、磷酸盐1.5wt%-3wt%、玉米浆10wt%-15wt%和葡萄糖8wt%-12wt%。

而且，所述基因工程菌采用分次补加底物、酒精、水的乳浊液的连续缓慢流加的发酵方法。

用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌在发酵生产A环1,2位脱氢酶中的应用。

一种甾体化合物A环1,2位脱氢发酵剂，包括权利用于甾体化合物A环1,2位脱氢的基因工程菌。

本发明的优点及有益效果如下：

1、本发明构建的工程菌在含有酵母提取物（5%-8%）、磷酸盐（1.5%-3%）、玉米浆（10%-15%）和葡萄糖（8%-12%）等营养成分的基础上，通过恒温通气搅拌发酵，在甾体化合物浓度不高于10%（g/L）时，采用一次加投甾体化合物底物，在32～48小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上；在甾体化合物浓度高于10%时，采用连续补加甾体化合物底物的情况下，在60小时内生物脱氢转化率能够达到95%以上。

2、本发明构建的菌株为进一步为通过分子手段改善生物转化制剂以及提高医药中间体和化学品的生物转化效率提供一种有效的方法，具有重要的实用意义。

附图说明

图1为本发明中重组载体的构建过程；

图2为本发明所构建载体pTY5PCR验证的核酸电泳图其中M:DNA Marker1、2均表示重组载体验证结果；

图3为本发明所构建菌株中PCR验证的核酸电泳图其中M:DNA Marker1、2：同源重组成功，3：未被重组；