[发明专利]一种基于胶乳的三聚氰胺快速检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学、医学、生物学和食品安全的交叉学科领域，更具体涉及一种基于聚苯乙烯胶乳微球检测三聚氰胺的方法。

背景技术

在食品行业中，通过凯式定氮法(GB/T5009.5-2010；第一法)测定氮原子含量从而间接计算蛋白质含量。近年来，一些不法商贩将化工原料三聚氰胺添加到食品或饲料中，以求提高通过凯式定氮法测定的表观蛋白含量。三聚氰胺可导致人体泌尿系统产生结石，如膀胱结石和肾结石等疾病，因此被严格禁止添加到食品中。

目前三聚氰胺的检测方法有高效液相色谱法、液质联用、气质联用法等，这些方法虽然检测灵敏度高，但前处理步骤操作时间长，仪器价格昂贵，且需取样并送回实验室进行检测，不适合样品中三聚氰胺的现场快速筛查。目前可用于现场快速检测的方法如酶联免疫吸附试验，相较之下应用起来较灵活，但检测成本依然很贵，对技术操作人员操作也有一定的技术要求，而胶体金卡虽然操作十分简便、但只能是定性分析，不能实现准确的定量分析。

免疫比浊法(J.M.Singer et al.,Am.J.Med.21,888-92;1956)主要用于微生物和病毒感染等的检测和临床诊断。在免疫比浊法中，将抗体包被在微球表面。当包含特定抗原的样品与乳胶悬液混合时，导致可见的凝集，增加了样品的浑浊度。通过测量样品与抗体包被乳胶悬液反应后的吸光度，并与使用已知浓度的抗原绘制的标准曲线进行比较，从而测定样品中抗原的浓度。

免疫比浊法中使用的微球包括多种类型，例如玻璃、硅石、纳米金属、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺颗粒等。可通过被动吸附或化学共价偶联，例如碳化二亚胺(EDC)法、溴化偶联等方式将抗体连接到微球上。在胶乳微球表面包被抗体的方法通常需要首先活化胶乳微球表面的官能团，使其能够与抗体蛋白反应。例如，通常使用EDC活化胶乳微球表面的羧基，使其与蛋白质的氨基偶联。

通常认为通过使用碳化二亚胺(EDC)/N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)的活化法更有利于蛋白质与微球之间的相互作用，因此是最为常用的偶联方法。此外，还有使用EDC/NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)混合物的活化法。然而，这两种方法中要先后使用两种试剂，反应系统和方法较为复杂，极易导致微球发生凝集，不利于抗体包被微球的工业化生产。

与此相比，单独使用EDC的活化法(或称作一步EDC法)的步骤较为简单且产率较高。然而，一步EDC法多用于不包含羧基的配体(例如寡核苷酸，如DNA)与表面带有羧基的微球之间的偶联。如果待偶联的配体也包含羧基基团(例如蛋白质，如抗体)，其可能被EDC活化，导致配体之间的聚合，从而无法获得期望的产物。

因此，需要开发一种避免微球或抗体之间相互凝集产生沉淀，从而适合稳定生产抗体包被微球的生产工艺，从而获得能够利用免疫比浊法快速、准确检测样品中的三聚氰胺。

发明内容

目前，EDC活化法中多使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)作为活化缓冲剂，但本发明人经实验发现使用MES缓冲的EDC溶液无法制备包被三聚氰胺抗体的微球溶液。本发明人经大量实验表明，在胶乳体系中，加入活化液后极易使带羧基的微球相互凝集产生沉淀，保持胶乳状态则需要改进活化缓冲液的成分。因此，本发明人对EDC活化法进行了大量研究，结果发现包含吐温20的磷酸盐缓冲液能够提供有利于抗体与微球之间偶联的最适环境，能够避免微球相互凝集产生沉淀，适合稳定生产抗体包被微球，从而完成了本发明。

在第一方面，本发明提供了一种包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液的制备方法，所述方法包括以下步骤：将表面带有羧基的胶乳微球稀释在活化缓冲液中，其中，所述活化缓冲液为包含0.5～1.0g/L吐温20的10～40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4-7.8。

在优选的实施方案中，本发明的制备方法使用一步EDC活化法活化所述胶乳微球表面的羧基。在本发明中，术语“一步EDC活化法”是指在活化过程中不使用除碳化二亚胺外的其他活化剂的EDC活化法。所述“其他活化剂”包括诸如Sulfo-NHS、NHS的试剂。

在一个具体实施方式中，本发明的制备方法包括以下步骤：

1)将表面带有羧基的胶乳微球稀释在活化缓冲液中，其中，所述活化缓冲液为包含0.5～1.0g/L吐温20的10～40mM磷酸盐缓冲液，pH7.4-7.8。

2)加入活化剂混合反应，其中所述活化剂为碳化二亚胺；

3)加入三聚氰胺单克隆抗体，进行包被反应；

4)加入淬灭液终止反应；

5)加入封闭液以封闭游离的羧基，从而获得包被三聚氰胺抗体的胶乳微球溶液。