[发明专利]一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法

权利要求书

1.一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步骤如下：

（1）将烤烟型烟草品种的种子播于苗盘中，待种子萌发且苗长至3～5 cm时，得处理后茎尖作为外植体备用；

（2）茎尖接种至附加吲哚乙酸0.02～0.05 mg·L^-1和赤霉素1.50～1.70 mg·L^-1，食用白糖10 g·L^-1，琼脂条8.5 g·L^-1的基本培养基中进行脱除烟草花叶病毒培养；基本培养基成份及使用用量：174 mg·L^-1(NH₄)₂SO₄，360 mg·L^-1KNO₃，122.5 mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，218 mg·L^-1KH₂PO₄；18.4 mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，24.9 mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O；12.4 mg·L^-1MnSO₄·4H₂O，7.2 mg·L^-1ZnSO₄·7H₂O，0.32 mg·L^-1KI；

（3）培养温度控制在52～54 ℃，培养48～54 d后，实现烟草花叶病毒脱除；

（4）当茎尖生长至1.0 cm时，即可切割0.05 cm的茎尖进一步开展无毒苗培养。

2.按照权利要求1所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步骤（1）中处理是指将2 cm的茎尖剪下并去除叶片和叶柄，在超净台上用70%酒精涮洗10 s，用饱和次氯酸钠溶液浸泡5 min，无菌水冲洗8次，用无菌滤纸吸干表面水分，切除被杀菌消毒剂损伤部分后切取0.05～0.20 cm的茎尖。

3.按照权利要求1或2所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于进行脱毒种苗高效快繁体系的建立；具体是待无毒茎尖生长至1.0～1.5 cm和基部生根后，在无菌条件下打开培养瓶，将植株留2叶切下苗干，并割成一叶一段再转接到上述基本培养基中进行腋芽萌发生长及茎段基部生根培养。

4.按照权利要求3所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于进行炼苗和移栽；具体是待无毒茎段基部发出3～5条根且长至1.0 cm以上，苗高达2 cm时，从培养瓶中取出试管苗，在含有5 mg·L^-1高锰酸钾溶液中洗去苗上残留的琼脂，然后植入经300倍液多菌灵消毒过的腐烂松针、草炭土和细河砂＝3:2:1混合的基质中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在70%，温度控制在22±2 ℃，每天自然光照10 h，每天中午揭开部分塑料薄膜进行通风换气30 min，10 d后揭去薄膜，每天早晨喷洒清水1次，无毒苗成活率达95.0%以上。

5.按照权利要求1所述的一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法，其特征在于步骤（2）中吲哚乙酸0.02 mg·L^-1和赤霉素1.50 mg·L^-1。