[发明专利]表达 PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种表达PCV2密码子优化ORF1和ORF2串联基因的重组病毒，属于生物工程领域，具体地说，涉及猪圆环病毒ORF1和ORF2密码子的优化、优化序列重组杆状病毒的获得及其制备的基因工程疫苗，属于基因工程疫苗领域。 

二、背景技术

猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒2型（PCV2）引起的猪传染性疾病，是猪的重要免疫抑制性疾病之一，该病已给全球养猪业造成了巨大的经济损失。众多学者认为，猪圆环病毒病会引起断奶后仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)及猪皮炎肾病综合征(PDNS)，同时还能引起母猪繁殖障碍、新生仔猪先天性震颤(CT)等疾病，也是猪呼吸道疾病综合征(PRDC)的原发病原之一。目前，国内外猪场普遍存在PCV2感染，我国自2000年报道PCV2感染的血清学证据以来，流行范围已波及全国，猪群平均阳性率最高高达60%，发病猪死亡率为10%-30%不等，较严重的猪场在爆发本病时死亡率高达40%，危害日益严重。 

目前，如何有效防控PCVD已成为全球养猪业关注的焦点。疫苗预防接种是控制本病的最有效手段，国内外研究者也在猪圆环病毒病疫苗研制方面开展了较多工作。首先是全病毒灭活疫苗，目前国内外都有注册的灭活疫苗，但总体而言，灭活疫苗对机体刺激时间比较短，需多次接种，而且PCV2在细胞上增殖滴度低，其制备费用远远高于其他疾病的灭活疫苗，且无法鉴别疫苗免疫与野毒感染，同时由于PCV2抵抗力强，普通灭活剂很难确保能彻底灭活病毒，存在潜在的生物安全风险；其次是亚单位疫苗，相对于其他疫苗，亚单位疫苗产生抗体更早，抗体水平稳定，能够有效阻止病毒的复制，保护力强，目前国外利用杆状病毒表达的Cap蛋白的亚单位疫苗已有注册，FortM等研究也表明该疫苗使用剂量相对较少，免疫效果好，对欧洲及北美的PCV2控制发挥了巨大作用；再次是减毒活疫苗，FenauxM等学者发现了PCV2的致弱位点，为减毒活疫苗的研制提供了方向，该疫苗虽然能够诱导很好的免疫应答，但长期使用存在反强的危险；另外也有学者对其活载体疫苗、核酸疫苗等进行研究，但都没有获得成品。众多研究表明，PCV2疫苗的研制方向应该是基因工程疫苗，尤其是亚单位疫苗。 

目前国外勃林格殷格翰动物保健公司的PCV2疫苗(CircoFlex)已在我国上市，2010年国内由姜平等和刘长明等研发的猪圆环病毒2型灭活疫苗，圆健-SH株和LG株也相继上市。国外疫苗价格十分昂贵，国内灭活疫苗又基于细胞增殖病毒，因PCV2在细胞上增殖滴度低、生产活疫苗和灭活疫苗费时又费力。因而在PCV2流行逐年上升，流行范围逐步扩大，各成长阶段的猪感染严重、混合感染突出、给全国养猪业造成了巨大损失的情况下，如何研制出一种免疫原性好、可以高效生产、价格合适的新型可商品化基因工程疫苗已成为当务之急。 

PCV2主要编码3个阅读框，ORF1编码与复制相关的蛋白即Rep蛋白；ORF2编码病毒的主要结构蛋白即Cap蛋白，是PCV2的主要免疫原；ORF3编码的蛋白与细胞凋亡有关。目前，由于Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白，因而基于Cap蛋白的表达以研制成疫苗的研究成为热点。杆状病毒表达系统以其表达外源性蛋白产量高、抗原性好、产物易纯化等优点，在众多疫病的研究中得到广泛应用。目前研究表明，利用杆状病毒表达Cap蛋白能够自我组装成类病毒粒子，且刘长明、FortM等研究表明，杆状病毒表达Cap蛋白具有很好的免疫原性。Maria Fort等研究显示PCV2的Cap蛋白和Rep蛋白都参与了PCV2感染后所介导的细胞免疫。最近又有研究表明，PCV2ORF2与ORF1串联的核酸疫苗、ORF1-2重组腺病毒免疫效果较单独的ORF1/ORF2核酸疫苗或ORF1、ORF2重组腺病毒显得更为优越。因而本发明，将ORF1和ORF2串联表达，以获得更好的免疫原性。 

目前，我国关于PCV2相关研究的报道，尤其是遗传变异情况的报道不断增多。有报道表明在中国，PCV2a可细分为2A、2D、2E亚型，PCV2b可细分为1A/1B、1C亚型，还可能存在既非PCV2a又非PCV2b的亚型PCV2c；温立斌等利用RFLP分析技术可将我国流行毒株分为9种基因型，即CHN-2A、CHN-2B、CHN-2C、CHN-2D、CHN-2E、CHN-2F、CHN-2G、CHN-2H和CHN-2I。可见我国PCV2存在基因多样性，因而根据单一的PCV2序列设计的疫苗无法对所有PCV2亚型提供很好的交叉保护。因此本研究将已知的PCV2基因进行系统进化树分析，取其一致序列（Consensus sequence），提高其交叉保护性。